細(xì)胞株周期的測(cè)定原理與操作步驟

一、細(xì)胞株原理

細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。

單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。

測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞 計(jì)數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測(cè)定細(xì)胞周期的方法。

BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過兩個(gè)細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞 如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期，則兩條單體均深染。計(jì)分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。

細(xì)胞周期的測(cè)定原理與操作步驟
二、儀器、用品與試劑

1、儀器、用品：同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)

2、試劑：BrdU(1.0mg/ml)，甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步驟

1、細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)期時(shí)，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使Z終濃度為10μg/ml。

2、44小時(shí)加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3、48小時(shí)后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。

4、常規(guī)染色體制片。

5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

6、棄去2×SSC液，流水沖洗。

7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

8、鏡檢100個(gè)分裂相，計(jì)*、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。

9、計(jì)算：

細(xì)胞株周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小時(shí))

附：

(1)BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。

(2)2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉•2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。
*    PBS，（10X）    pH 7.4    70011-044    500ml
*    RPMI 1640，（1X），液體（IVD）    含L-谷氨酰胺    11875-093    500ml 
*    RPMI 1640，（1X），液體（IVD）    含25mM HEPES，和L-谷氨酰胺    22400-089    500ml
*    "RPMI 1640，干粉
（IVD）"    含L-谷氨酰胺，不含碳酸氫鈉    31800-022    10*1L
*            31800-089    1*10L
*    "RPMI 1640，干粉
（IVD）"    含L-谷氨酰胺，25mM HEPES，不含碳酸氫鈉    23400-021    10*1L
*    RPMI 1640，（1X），液體 （ IVD）    不含L-谷氨酰胺    21870-076    500ml
細(xì)胞株