ATCC細胞轉染后陽性克隆的鑒定

 ATCC細胞真核雙基因共表達載體phTERT-IRES-SV40轉染bMGEs, 48 h后用G418抗性藥物加壓篩選。約3周后, 獲得陽性克隆, 命名為HL-bMGEs, 挑取單克隆擴大培養(圖3)。獲得的單克隆以“鋪路石”樣細胞類型生長。繼續擴大培養, 細胞仍以緊密單層生長方式增殖, 細胞體外持續培養達30代依然生長旺盛。

轉染后陽性克隆的RT-PCR鑒定

分別從篩選出的陽性細胞HL-bMGEs和未轉染的bMEGs中提取基因組mRNA, RT-PCR擴增hTERT 和SV40 LT, 陽性細胞基因擴增的產物長度為3.45 Kb 和363 bp, 未處理組為陰性結果, 所得結果與預期的一致。

Western blot鑒定phTERT-IRES-SV40陽性克隆

Western blot檢測結果表明, 第15代陽性細胞 HL-bMGEs中的hTERT和SV40 LT均能正常表達, 蛋白分子量為125 kDa和94 kDa。陰性細胞bMGEs中 hTERT和SV40 LT不表達。內參β-action在陽性細胞和對照均穩定表達, 蛋白分子量為43 kDa。

流式細胞鑒定陽性細胞增殖能力

利用流式細胞技術進行陽性細胞周期分析。隨機選取第10代HL-bMGEs, 對照組為未轉染phTERTIRES-SV40、正常培養的bMGEs第10代。通過流式ATCC細胞儀數據分析表明, HL-bMGEs的細胞周期活動是從G0/G1期向G2期過渡, 處于S期細胞占細胞總數為27.2%, 陽性細胞中第10代細胞S期相對較高。對照組的細胞大部分處于G0期, 處于S期細胞則相比較低(對照組為10.7%)。結果表明, 陽性細胞具有較強的增殖能力。
甲基斑蝥胺    HPLC法含量測定    50mg    100465-200401
呋喃唑酮    含量測定    100mg    100466-200401
嗎多明    含量測定    100mg    100467-200701
替加氟    HPLC法含量測定    50mg    100468-200401
尿嘧啶    HPLC法含量測定    50mg    100469-200401
檸檬烯    含量測定    200mg    100470-200701
溴丙胺太林    HPLC法含量測定    50mg    100471-200301
鹽酸妥洛特羅    HPLC法含量測定    50mg    100472-200401
鹽酸環侖特羅    UV法含量測定    50mg    100473-200401
溴甲東莨菪堿    含量測定    50mg    100476-200301
無水磷酸氫二鈉    含量測定    100mg    100480-200501
ATCC細胞