細胞計數(shù)實驗中易犯的錯誤

實驗原理：當待測ATCC細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目。

細胞計數(shù)實驗中初學(xué)者易犯的錯誤
具體操作：

一.準備工作：

取一瓶傳代的細胞，按照《傳代細胞培養(yǎng)(消化法)》中的傳代方法繁殖細胞，待長成單層后以被使用.

二.細胞懸液制備：

用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液(或hanks液或PBS等平衡鹽溶液)，吹打制成待測細胞懸液。

三.細胞計數(shù)：

1.取一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上.

2.制備計數(shù)用的細胞懸液：用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍染液(0.4%)或苯胺黑。活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。

3.將細胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

4.統(tǒng)計四個大格的細胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個大鉻(每個大格含有16個中鉻)中沒有被染液染上色的細胞數(shù)目。

5.計算原細胞懸液的細胞數(shù):按照下面公式計算細胞密度：

細胞懸液的細胞數(shù)/ml=(四個大格子細胞數(shù)/4)×2×104

說明：/4因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù);×2因細胞懸液：染液=1：1稀釋;×104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1mm3 而 1ml=1000mm3

四.細胞計數(shù)要點：

1.進行細胞計數(shù)時，要求懸液中細胞數(shù)目不低于104個/ml，如果細胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中;

2.要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數(shù)準確性。

3.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準確;

4.數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。

5. 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。

五.初學(xué)者易犯的錯誤：

1. 計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。

2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

3. 滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

六.本實驗特殊試劑的配制：

4%臺盼藍母液：稱取4克臺盼藍，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。

使用液：使用時，用PBS稀釋母液至0.4%即可。

細胞的凍存

1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。

2.接著置于-20℃冰箱，約30-60min。

3.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。

4.置于液氮罐中長期保存。

5同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項：

1.使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破華它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時戴上手套操作。

2.不宜將凍存細胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險溫區(qū)”。

3.注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時添加。

簡便方法：

胰蛋白酶液消化>>離心>>PBS液1ml洗滌，吹打制成待測細胞懸液>>取1ul懸液+9ulPBS>>細胞計數(shù)：

1.蓋好蓋玻片：取一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上.

2.用10ul槍頭將細胞懸液注入計數(shù)板，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

3.統(tǒng)計四個大格的細胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個大鉻(每個大格含有16個中鉻)的細胞數(shù)目。

4.計算原ATCC細胞懸液的細胞數(shù):按照下面公式計算細胞密度：

(細胞懸液的細胞數(shù))/ml=(四個大格子細胞數(shù)/4)×106
對照品    含量：    進口/國產(chǎn)    頭孢克洛    20mg/支    英文名稱    含量測定    規(guī)格:
對照品    含量：    進口/國產(chǎn)    苯唑西林    20mg/支    英文名稱    含量測定    規(guī)格:
對照品    含量：    進口/國產(chǎn)    頭孢噻肟    20mg/支    英文名稱    含量測定    規(guī)格:
對照品    含量：    進口/國產(chǎn)    頭孢他啶    20mg/支    英文名稱    含量測定    規(guī)格:
對照品    含量：    進口/國產(chǎn)    多西環(huán)素    20mg/支    英文名稱    含量測定    規(guī)格:
對照品    含量：    進口/國產(chǎn)    克林霉素磷酸酯    20mg/支    英文名稱    含量測定    規(guī)格:
對照品    含量：    進口/國產(chǎn)    土霉素    20mg/支    英文名稱    含量測定    規(guī)格:
ATCC細胞