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    免疫組化抗體選擇流程

    時間:2025/7/1閱讀:108
    分享:

    選擇免疫組化抗體時,需要考慮多個關鍵因素以確保實驗的準確性和特異性。以下是一步一步的流程:

    1. 確定目標蛋白:

      明確您想要檢測的蛋白名稱,包括中英文名字、別名等信息。

      檢查目標蛋白的同分異構體、功能域、加工形式以及可能的翻譯后修飾,以確保選擇的抗體能識別您的特定目標。

    2. 確認抗體特異性:

      驗證抗體說明書中的UniProt ID是否與您的目標蛋白一致,避免同源蛋白的交叉反應。

      使用NCBI BLAST工具分析目標蛋白序列,確認抗體不會與相似序列的其他蛋白質發生非特異性結合。

    3. 選擇一抗類型:

      單克隆抗體(mAb)具有高度特異性,適用于需要高特異性的實驗,但可能對目標抗原的微小變化敏感度較低。

      多克隆抗體(pAb)特異性稍弱,但親和力強,能識別抗原的多個表位,適用于檢測微小變化的抗原,但可能產生非特異性染色。

    4. 確定實驗應用:

        確認所選抗體適用于免疫組化(IHC)。一些抗體可能僅適用于WBIF,而特定的IHC抗體可能需要特殊的固定條件或抗原修復步驟。

    5. 種屬匹配:

      選擇能與您的實驗樣本種屬反應的抗體。如果樣本是小鼠,避免使用小鼠或大鼠來源的一抗,以免二抗與內源性免疫球蛋白交叉反應,導致背景過高。

      查看抗體說明書中的Species Reactivity"部分,選擇已驗證適用于您樣本種屬的抗體。

    6. 一抗來源:

      了解一抗的宿主物種,這對于免疫組化非常重要,因為一抗的宿主物種決定了二抗的選擇。例如,小鼠來源的一抗需要搭配抗小鼠的二抗。

    7. 選擇二抗:

      根據一抗的宿主物種選擇相應的二抗。二抗通常會偶聯HRP、生物su或熒光素等標記物,用于檢測一抗的結合。

      在多色實驗中,確保二抗之間沒有交叉反應,并且適合您的檢測系統(如熒光顯微鏡或化學發光)。

    8. 抗體驗證:

      優先選擇經過廣泛驗證的抗體,可以通過查看文獻引用情況來判斷。

      比較不同供應商的抗體說明書,選擇那些在多種應用中表現良好的抗體。

      考慮抗體的“金標準",如Human Protein AtlasHPA)數據庫中的金標抗體,這些抗體經過嚴格驗證,具有高特異性和一致性。

    9. 性價比考量:

      在滿足實驗需求的前提下,比較不同抗體的規格、稀釋比例和單次實驗成本,選擇性價比高的抗體。

    10. 實驗條件優化:

       即使選擇了合適的抗體,也需要通過實驗優化條件,如抗原修復方法、封閉劑選擇、孵育時間和溫度等,以獲得最佳結果。

    遵循這些步驟,結合參考內容中的詳細指導,可以幫助您正確選擇免疫組化抗體,從而獲得可靠和準確的實驗結果。


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