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    細胞凋亡檢測的分離方法

    時間:2017-8-14閱讀:232
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    在外周血中,要分離到足夠數量的細胞凋亡檢測,通常不用比重為1.077的細胞分層液,因為單核細胞的比重與淋巴細胞近似,且含量僅為3%-8%,故很難將兩者分開。而如用黏附法,則黏附細胞的剝離較難控制,剝離過度易造成細胞損傷,剝離不全使細胞回收率下降。那有沒有什么方法可以分離單核細胞呢,小編整理了兩個方法一起來看下吧!

    實驗原理

    PBMC的密度與血液中的其他成分不同。紅細胞和粒細胞的密度較大,為1.092左右;淋巴細胞和單核細胞的密度為1.076~1.090;血小板為1.030~1.035。因此,利用一種密度介于1.076~1.090之間、近于等滲的溶液(分層液)進行密度梯度離心,可使不同類別的血細胞按其相應密度分布,從而被分離。

    實驗步驟

    1. 聚蔗糖-*分層液法

    聚蔗糖-*(Ficoll-hypaque,F-H)分層液為密度梯度離心法常用的分離液,其主要成分是聚蔗糖和*。聚蔗糖 (Ficoll) 分子量為40kD,具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點;常用的Ficoll溶液濃度為6%,密度為1.020。* (Hypaque) 用來增加密度,適量加入密度為1.200、濃度為34%的Hypaque于Ficoll溶液中,配成密度為1.077±0.001的分層液,稱為淋巴細胞分層液,用于淋巴細胞的分離。

    分離細胞時,將肝素抗凝全血疊加在分層液上,使兩者形成一個清晰的界面。水平離心后,形成不同層次的液體和細胞區帶,從而分離出PBMC。紅細胞和粒細胞密度大于分層液,同時因紅細胞遇Ficoll而凝集成串錢狀,沉積于分層液底部;血小板因密度小而懸浮于血漿中;PBMC的密度稍低于分層液,故位于血漿層和分層液的界面中,呈白膜狀。吸出單個核細胞,計數,用臺盼藍染色檢查細胞活力。

    本法分離單個核細胞的純度可達95%,細胞獲得率達80%以上,細胞活性達95%以上小鼠淋巴細胞的比重與人淋巴細胞比重不同,若分離小鼠淋巴細胞應選用小鼠淋巴細胞分離液,比重1.092±0.001。

    2. Percoll分層液法

    Percoll是經過聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrolidone, PVP)處理的硅膠顆粒混懸液,對細胞無毒性和刺激性

    Percoll混懸液的硅膠顆粒大小不一,經過高速離心后,可形成一個連續密度梯度,將比重不同的細胞分離純化。

    1) 將1份10XPBS與9份Percoll貯存液混合,制成等滲Percoll懸液,此懸液被認為是Percoll懸液,其密度為1.1294g/ml。用PBS或細胞培養液稀釋Percoll而獲得所需密度的Percoll分離液用于相應細胞的分離。若分離淋巴細胞凋亡檢測應使用1.0777g/ml,配制時用稀釋液稀釋60%即可。

    2) 取比重1.077的Percoll分離液X ml與離心管中,將等倍稀釋的抗凝血1/2 X ml 小心疊加在分離液上,經水平離心(1500rpm)后,便得四個細胞層,從而分離出淋巴細胞。表層為死細胞殘片和血小板,底層為粒細胞和紅細胞,中間有兩層,上層富含單核細胞,下層富含淋巴細胞。

    3) 該法是純化淋巴細胞和單核細胞的一種較好的方法,淋巴細胞純度高達98%,單核細胞純度可達78%。
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