細(xì)胞培養(yǎng)克隆的制備

細(xì)胞培養(yǎng)克隆，是將一個(gè)單細(xì)胞從細(xì)胞群中分離出來單獨(dú)培養(yǎng)，使之重新繁衍成一個(gè)新的單一細(xì)胞群的培養(yǎng)技術(shù)。未經(jīng)克隆化的細(xì)胞具有異質(zhì)性，經(jīng)過克隆得到的是均一細(xì)胞集團(tuán)。這里僅介紹T細(xì)胞與NK 細(xì)胞的克隆方法。
基本原理
用限度稀釋克隆形成法制備T 細(xì)胞克隆時(shí)，并非依賴細(xì)胞 的特性，而是將T 細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板上稀釋到統(tǒng)計(jì)學(xué)的濃度，即從理論值上達(dá)到每孔1 個(gè)細(xì)胞，其中加入IL－2 和PHA 可增強(qiáng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，而加入的同種異體PBMC 作為飼養(yǎng)細(xì)胞，在這種體系中，單個(gè)T 細(xì)胞可增殖生長(zhǎng)成細(xì)胞集團(tuán)，即T 細(xì)胞克隆。
試劑和材料
●提純T 細(xì)胞（參見*章之第六節(jié)）
● 飼養(yǎng)細(xì)胞（以50GYγ射線照射）：從兩個(gè)不同供者獲得的同種異體PBMC從理論上認(rèn)為兩者的每一演變均不同。
● 培養(yǎng)基：RPMI1640 培養(yǎng)液（RPMI1640 液＋1mmol/L 丙酮酸鈉＋2mmol/L *＋100u/ml*和100μg/ml *）再加入熱滅活的10％的AB 型血清。
● 按說明書所述，將PHA－A 溶于雙蒸水中。
● 含有104u/ml hrIL－2 的PBS 液中加入1％牛血清白蛋白（BSA）。
● 器皿、儀器：96 孔U 型低細(xì)胞培養(yǎng)板及24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，垂直氣流超凈臺(tái)，CO2 孵箱，倒置顯微鏡等。
實(shí)驗(yàn)操作
1.培養(yǎng)板的準(zhǔn)備
T 細(xì)胞克隆的制備1） 應(yīng)用典型的有限稀釋克
隆形成法，以0．5 個(gè)/孔、1 個(gè)/孔、5 個(gè)/孔等三種不同細(xì)胞濃度準(zhǔn)備三塊96 孔U 型培養(yǎng)板，以及半塊
為10 個(gè)/孔濃度的96 孔培養(yǎng)板。
2） 準(zhǔn)備含有5×105/ml 飼養(yǎng)細(xì)胞（經(jīng)γ射線照射）的RPMI1640培養(yǎng)液，并加入20u/ml 的IL－2 和1μg/ml PHA－A。
3） 在3 塊半96 孔板上，每孔均加入100μl 飼養(yǎng)細(xì)胞（50000個(gè)）。
4） 準(zhǔn)備稀釋T 細(xì)胞的培養(yǎng)（圖2－3）
5） 如圖2－3 所示，準(zhǔn)備3 支15ml 試管，內(nèi)含5ml 細(xì)胞培養(yǎng)液（CM）加20u/ml IL－2，將4 支試管分別稀釋并接種96 孔板，步驟如下：
（1） 第1 管加50μl 稀釋液C，相當(dāng)50 個(gè)細(xì)胞，混勻后加在96 孔板上，50μl/孔，此板為0．5 細(xì)胞/孔。
（2） 第2 管加100μl 稀釋液C，相當(dāng)100 個(gè)細(xì)胞，混勻后加在96 孔板上，50μl/孔，此板為1 細(xì)胞/孔。
（3） 第3、4 管各加500μl 稀釋液C，相當(dāng)500 個(gè)細(xì)胞，第3 管為500 細(xì)胞/5mlCM,，混勻后加在96 孔板上，50μl/孔，此板為5 細(xì)胞/孔; 第4 管為500 細(xì)胞/2．5mlCM,，混勻后僅夠加半個(gè)板，50μl/孔，此板為10 個(gè)細(xì)胞/孔。
4 塊96 孔板上有50μl 不同濃度T 細(xì)胞懸液加到含有100μl 飼養(yǎng)細(xì)胞的各孔中（IL－2 的終濃度應(yīng)為20u/ml）。
T 細(xì)胞克隆的制備2.T細(xì)胞克隆培養(yǎng)
1） 如圖2－4 所示，每隔2－3 天吸棄50μl培養(yǎng)上清液，加入50μl 含有IL－2 的新鮮培養(yǎng)液，使其終濃度達(dá)20u/ml；每隔10－15 天吸棄50μl 培養(yǎng)上清液，加入50μl 含有新鮮飼養(yǎng)細(xì)胞（50000/孔）、IL－2（終濃度達(dá)20u/ml）和PHA－A（終濃度達(dá)1μg/ml）的培養(yǎng)液。2） 經(jīng)21－25 天后出現(xiàn)克隆細(xì)胞生長(zhǎng)孔，首先在10 細(xì)胞/孔的板上出現(xiàn)，當(dāng)在1 細(xì)胞/孔的板上出現(xiàn)克隆生長(zhǎng)時(shí)，即可將5 細(xì)胞/孔和10 細(xì)胞/孔的兩塊板丟棄。
3） 當(dāng)0．5 細(xì)胞/孔和1 細(xì)胞/孔兩板上長(zhǎng)出的細(xì)胞克隆變大時(shí)，將該孔的100μl 培養(yǎng)液懸浮混勻，分裝于96 孔板2 個(gè)孔內(nèi)，50μl/孔，而且每孔已預(yù)先加有上述飼養(yǎng)細(xì)胞（50000/孔）。
4） 隨著細(xì)胞的繼續(xù)生長(zhǎng)，用同法可將同一克隆細(xì)胞分裝擴(kuò)充為4 孔，當(dāng)分裝成8 孔時(shí)，可匯總這8 孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24 孔板的1 孔內(nèi)。
5） 細(xì)胞培養(yǎng)克隆可在如此條件下維持其生長(zhǎng)，即每隔2－3 天更換含有IL－2（20u/ml）的新鮮培養(yǎng)液，每隔10－15 天更換含有新鮮飼養(yǎng)細(xì)胞、IL－2（20u/ml）和PHA（1μg/ml）的培養(yǎng)液，其中加入飼養(yǎng)細(xì)胞的比率應(yīng)為T 細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)0．5－1×106 細(xì)胞需106 飼養(yǎng)細(xì)胞。
鄰硝基*    *    500ku    
對(duì)硝基*    *    25ku    
鄰硝基苯胺    進(jìn)口/國(guó)產(chǎn)    125ku    
對(duì)硝基苯胺    *    10u    2～8℃
間硝基苯胺    *    100u  
細(xì)胞培養(yǎng)