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    人促紅素(EPO)注射液標準升級中,N糖和唾液酸該如何檢測?

    閱讀:133      發布時間:2025-3-17
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    人促紅細胞生成素(EPO)是一種重要的糖蛋白藥物,廣泛應用于治療貧血等疾病。EPO可以結合紅系祖細胞上的相應受體促進紅細胞的生成,抑制其凋亡,增加紅細胞的數量,從而增加機體的氧氣運輸能力。然而,EPO的療效和安全性與其N-連接糖基化(N-glycosylation)密切相關。N糖結構的微小變化可能直接影響EPO的生物學活性、穩定性和免疫原性。[1,2]因此,N糖測定成為EPO質量控制中的一環。今天,我們就來聊聊N-糖測定的重要性,以及高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)在這一領域中的優勢。

    人促紅素(EPO)注射液標準升級中,N糖和唾液酸該如何檢測? 

    圖1. EPO的結構

    (點擊查看大圖)

     

     

    1. EPO的N糖測定為何如此重要?

     

    影響生物學活性

    EPO的N糖結構直接影響其與紅細胞生成素受體的結合能力,進而調控其生物學活性。EPO的3個N-糖鏈均可包含2-4個分支,每個分支末端均可為帶負電的唾液酸,O-糖鏈也可帶有最多2個唾液酸,這些唾液酸決定了整個分子的整體負電荷,也導致了促紅素整體復雜的電荷異質性。唾液酸摩爾數量的增加可以增加促紅素的半衰期。

    決定藥代動力學特性

    N糖鏈中的唾液酸含量與EPO在體內的半衰期密切相關。唾液酸化程度高的EPO能夠避免被肝臟快速清除,從而延長藥效。

    確保穩定性和安全性

    N糖鏈可以保護EPO分子免受降解,并降低其免疫原性。如果N糖結構異常,可能導致EPO聚集或引發免疫反應,影響治療效果。

    監控生產工藝一致性

    N糖糖譜是EPO質量控制的重要指標,能夠反映生產工藝的穩定性和產品的一致性。

     

     

    2. HPAEC-PAD用于N糖糖譜測定的流程

     

    人促紅素(EPO)注射液標準升級中,N糖和唾液酸該如何檢測? 

    圖2. EPO的N糖測定流程

    (點擊查看大圖)

    樣品前處理流程:

    ● 酶解 取供試品適量,用磷酸鹽緩沖液置換供試品的緩沖體系并制成每 1ml 約含人促紅素蛋白 2.0mg 的溶液。取 100μl,加糖苷酶F溶液 4μl,混勻,置 37℃保溫 16 小時。

    ● 除蛋白 加入-20℃預冷的乙醇 0.3ml,混勻,置-20℃至少 30 分鐘,于 4℃不低于14000g 離心 15 分鐘,取上清液,必要時采用適宜方式除鹽后真空干燥,加水 0.20ml 復溶。

    儀器配置及色譜條件:

    儀   器:Dionex™ ICS-6000 型離子色譜儀

    色譜柱:Dionex™ CarboPac™ PA200 色譜柱;

    柱   溫:30℃;

    淋洗液:以50mmol/L 氫氧化鈉溶液為流動相 A,以 0.2mol/L 氫氧化鈉溶液為流 動相 B,以含有 50mmol/L 氫氧化鈉溶液和 0.25mol/L 乙酸鈉溶液為 流動相 C,梯度洗脫;

    流   速: 0.5ml/min;

    檢測器:脈沖安培檢測器,金工作電極,Ag-AgCl參比電極,糖四電位波形。

    人促紅素(EPO)注射液標準升級中,N糖和唾液酸該如何檢測? 

    圖3. 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定EPO中的N糖糖譜(點擊查看大圖)

     

     

    3. HPAEC-PAD用于N糖糖譜測定的優勢

     

    高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)是目前EPO N-糖和唾液酸測定中的技術之一。它的核心優勢在于:

    a) 前處理簡單

    該方法不需衍生,酶解后的樣品可直接進樣,省時省力。

    b) 高靈敏度檢測

    脈沖安培檢測器(PAD)對糖類物質具有靈敏度,無需復雜的樣品前處理或衍生化步驟,即可實現微量糖鏈的精準檢測。

    c) 高效分離

    HPAEC-PAD利用陰離子交換色譜柱,能夠高效分離復雜糖鏈,即使是結構相似的N-糖鏈也能清晰區分。

    d) 定量分析能力強

    HPAEC-PAD不僅可以定性分析N糖鏈的結構,還能精確測定各糖鏈的相對含量,為EPO的質量控制提供可靠數據。

    e) 可與高分辨質譜聯用

    HPAEC與高分辨制質譜聯用,可以實現單個N糖的結構確證。

     

     

    4. HPAEC-PAD用于唾液酸的含量測定                                                   

     

    EPO的不均一性很大程度上是由糖鏈末端唾液酸化引起的,唾液酸化程度的高低直接影響著促紅素蛋白的體內半衰期,與EPO的生物學體內活性相關,是重要的質控指標。HPAEC-PAD對唾液酸同樣有良好的檢測能力。

    人促紅素(EPO)注射液標準升級中,N糖和唾液酸該如何檢測? 

    圖4. 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定EPO中的唾液酸含量(點擊查看大圖)

    a) 與C6H6O2法相比【3】

    優勢:HPAEC-PAD法靈敏度和專屬性更高,可同時測定不同結構操作簡單。

    局限:HPAEC-PAD法較C6H6O2法成本較高。

    b) 與液相色譜法(HPLC)相比

    優勢:HPAEC-PAD測定唾液酸不需衍生,前處理更簡單,節省時間和試劑,結果更準確。

    局限:離子色譜不及液相色譜普及。

     

     

    5. 總結

     

    EPO的N糖糖譜和唾液酸測定是確保其質量、安全性和有效性的關鍵步驟,而HPAEC-PAD憑借其高分辨率、高靈敏度和強大的定量分析能力,成為這一領域的技術。無論是科研還是生產,HPAEC-PAD都為EPO的N糖分析和唾液酸分析提供了可靠的技術支持。未來,隨著技術的不斷發展,HPAEC-PAD有望在更多生物制品的質量控制中發揮更大作用!

     

    互動話題:

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    你對EPO的N糖測定還有哪些疑問?或者你對HPAEC-PAD技術有什么看法?歡迎在評論區留言討論!

    參考文獻:

    1. 李響,秦璽,裴德寧,等. 促紅素N-糖鏈的超高壓液相色譜分析方法驗證[J]. 中國新藥雜志,2024,33(6):598-604.DOI:10.3969/j.issn.1003-3734.2024.06.012.

    2. 李響,于雷,范文紅,等. 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法用于……中唾液酸的含量測定[J]. 中國醫藥導報,2018,15(27):102-105.

    3. 《中國藥典》2020年版

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