生物制藥微課堂|第三期-單克隆抗體藥物的電荷變異體表征

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單克隆抗體是復雜的糖蛋白，通常呈現微觀不均一性，包括各種修飾形成的變異體。這些變異體可能來自復雜的細胞培養工藝、純化及制劑等制造過程或儲存過程的任何階段。由于抗體所帶電荷差異造成的異質性稱為電荷變異體，這些變異體可能會影響抗體的穩定性，藥效，免疫原性等，因此對電荷變異體的表征和質控至關重要。通過對變異體的分子量及肽圖的表征，可以確定其修飾種類及后續QC中的質量監控。

本期微課堂為您帶來：

單克隆抗體藥物電荷變異體分析解決方案

賽默飛提供兩種方案，讓您的分析選擇更靈活，輕松應對！

方案1：在線CEX-MS方案

本期微課堂來自NIBRT的Jonathan Bones報告，介紹了如何使用在線CEX-MS的分析方法快速在完整蛋白水平上表征變異體修飾。
 

Advances in Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies Using pH Gradient Cation Exchange Chromatography hyphenated to Mass Spectrometry

要點1：

電荷變異體分析常用的PH梯度或鹽梯度方法，其流動相一般含不揮發性鹽，需要色譜分離后再接餾分，除鹽凍干再進質譜分析，這一復雜過程容易造成樣品損失及蛋白變性。因此在線CEX-MS的分析方法能夠很好的解決這一問題，通過使用低離子強度、揮發性鹽的流動體系，在PH梯度條件下分離電荷變異體，同時進質譜分析，能夠快速在完整蛋白水平上表征變異體修飾，包括C端賴氨酸變異體、脫酰胺、焦谷氨酸環化、糖化以及抗體相關片段等。

CVA-MS on Q Exactive Plus MS

要點2：

對于在線CEX-MS分析，怎樣在保證完美的色譜分離度情況下，準確檢測每個色譜峰對應的修飾種類？此次報告會詳細介紹流動相的選擇、PH條件優化及阿達木單抗、西妥昔單抗的具體案例分析，以及如何根據所得數據分析電荷變異體的來源，例如由于宿主細胞殘留蛋白的存在而造成單抗降解為不同的片段等。

CEX-MS analysis of Adalimumab

要點3：

Zipchip-MS微流控毛細管電泳質譜作為CEX-MS的互補技術，在電荷變異體分析中有很好的性能，可在更短的分析時間，使用少量樣品，得到完整的電荷變異體數據。對于酸性蛋白質，可使用AEX-MS分析，能夠在低PH梯度下觀測到更多蛋白異構體，如唾液酸化、巖藻糖基化修飾及降解片段等。該部分內容作為CEX-MS的互補技術，會以實際案例來說明如何從全方面表征抗體電荷變異體。

AEX-MS analysis of Ovalbumin

方案2：離線CEX-MS分析方案：

賽默飛離線CEX-MS方案，包括超高效液相Vanquish，餾分收集器，及超高分辨質譜Orbitrap，可以從完整蛋白、亞基及肽圖三個層面對離子交換酸堿峰進行深度表征分析。相比在線CEX-MS方案，該方法可以使用非揮發性鹽，使CEX的方法優化更簡便，但需要增加凍干除鹽等步驟，可根據不同需求選擇合適方案。

完整分子量分析：

如下圖1所示，收集CEX分離所得餾分，經過除鹽凍干處理，LC-MS檢測，可在完整分子量層面觀測到各個餾分的糖型分布情況，大部分糖基化修飾形成酸性峰，C端賴氨酸丟失及酰胺化等修飾形成堿性峰^[1]。

圖1：CEX餾分完整分子量分析

輕重鏈分析：

輕重鏈分析可進一步在分子量層面觀測到更多的信息，如加速穩定性實驗中，不同的溫度及PH條件下，蛋白藥物會發生氧化及降解等反應。將CEX分離的餾分經過DTT還原等處理，通過orbitrap檢測，在超高分辨的性能下可測得輕鏈單同位素分子量，并觀測到微小變化的修飾峰，下圖所示為CEX的某個餾分經DTT還原后的質譜分析結果，測得輕重鏈及氧化、脫水、糖化等雜質峰^[2]。

肽圖分析：

肽圖分析能夠精確定位翻譯后修飾位點及發現更低豐度的修飾，如下圖所示，通過對三個酸性峰AF1-AF3及堿性峰BF1、BF2餾分進行肽圖分析，可確定每個餾分包含的修飾種類及相對含量，相對含量僅為0.01%的修飾也能被準確鑒定，其中紅色標注為主要修飾。Orbitrap的超高靈敏度和分辨率能夠檢測到更多含量的PTMs及序列變異體，尤其對于餾分收集樣品，更需要高靈敏度檢測方法。

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單克隆抗體藥物電荷變異體分析相關解決方案

參考文獻：

1. François G, Blandine D, et al. Unbiased in-depth characterization of CEX fractions from a stressed monoclonal antibody by mass spectrometry. mAbs, 2017. 

2. Deyun W, Colin W, et al. Characterization of Drug Product-related Impurities and Variants of a Therapeutic Monoclonal Antibody by Higher-energy C-trap Dissociation Mass Spectrometry. Anal. Chem.,2014.

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