大鼠內(nèi)皮型NO合酶（eNOS）ELISA檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

大鼠內(nèi)皮型NO合酶（eNOS）ELISA檢測試劑盒檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被大鼠內(nèi)皮型NO合酶（eNOS）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成Z終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠內(nèi)皮型NO合酶（eNOS）活性呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品活性。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1.     酶標(biāo)儀（450nm）

2.     高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.     37℃恒溫箱

操作注意事項(xiàng)

1.  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。

2.  實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.  標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液即可視為陰性對照或者空白；預(yù)處理后的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可。

4.  嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.  所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

微孔酶標(biāo)板

12孔×8條

12孔×4條

無

標(biāo)準(zhǔn)品（48 U/L）

0.6mL

0.6mL

按說明書進(jìn)行稀釋

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

6mL

3mL

無

樣本稀釋液

6mL

3mL

無

檢測抗體-HRP

10mL

5mL

無

20×洗滌緩沖液

25mL

15mL

大鼠內(nèi)皮型NO合酶（eNOS）ELISA檢測試劑盒按說明書進(jìn)行稀釋

底物A

6mL

3mL

無

底物B

6mL

3mL

無

終止液

6mL

3mL

無

封板膜

2張

2張

無

說明書

1份

1份

無

自封袋

1個

1個

無

注：標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液依次稀釋為：48、24、12、6、3、1.5 U/L

試劑的準(zhǔn)備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.  自動洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3.  待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

4.  隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

試劑盒性能

1.  準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

2.  靈敏度：Z低檢測濃度小于1.0 U/L。

3.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4.  重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  大鼠內(nèi)皮型NO合酶（eNOS）ELISA檢測試劑盒有效期：6個月