大鼠肺泡巨噬細(xì)胞技術(shù)參數(shù)

大鼠肺泡巨噬細(xì)胞介紹
NR8383 (正常大鼠，1983年)來源于肺灌洗時(shí)的正常大鼠肺泡巨噬細(xì)胞。細(xì)胞在gerbil肺細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)液存在下培養(yǎng)了大約8-9個(gè)月。隨后，不再需要外源生長因子。通過有限稀釋法從單個(gè)細(xì)胞克隆并亞克隆NR8383細(xì)胞，并三次用軟瓊脂亞克隆。細(xì)胞表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞的特性，吞噬酵母多糖和銅綠，非特異性脂酶活性，F(xiàn)c受體，氧化降解；分泌IL-1, TGF-β和IL-6，可重復(fù)地響應(yīng)外源生長因子。NR8383細(xì)胞響應(yīng)博萊霉素，分泌TGF-β前體。在博萊霉素刺激下，TGF –β mRNA表達(dá)也上升。細(xì)胞對內(nèi)毒素敏感。1-10 鈉克/毫升的LPS水平抑制增生達(dá)50%。 即使達(dá)到0.001毫克/毫升的水平，LPS抑制還是無毒且在后續(xù)過程中可逆的。NR8383細(xì)胞株提供了高響應(yīng)的肺泡巨噬細(xì)胞的均一來源，可以用于體外研究巨響細(xì)胞相關(guān)活性。
 
細(xì)胞特性
1） 來源：肺；巨噬細(xì)胞 
2） 形態(tài)：巨噬細(xì)胞，半懸浮生長
3） 含量：>1x106 個(gè)/mL
4） 污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測為陰性
5） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝
 
運(yùn)輸和保存

可選擇干冰運(yùn)輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細(xì)胞方式

（1）干冰運(yùn)輸，收到后立即轉(zhuǎn)入液氮或者-80度冰箱凍存或直接復(fù)蘇；

（2）存活細(xì)胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長，傳代達(dá)到細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。

（3）收到細(xì)胞后請拍照，3天內(nèi)如果發(fā)現(xiàn)污染，請及時(shí)拍照與我們。

細(xì)胞接收后的處理：
1） 收到細(xì)胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們。
2） 請先在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長狀態(tài)，酒精消毒瓶壁并將T25瓶置于37℃培養(yǎng)約2-3h。
3） T25瓶中的培養(yǎng)基取出離心后，去上清，添加6ml新的*培養(yǎng)基，重新加入原T25培養(yǎng)瓶。
4） 如果細(xì)胞長滿90%請及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代培養(yǎng)用本公司附帶的*培養(yǎng)基。
 
大鼠肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞用途：僅供科研使用。
                       
細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程，供參考
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；胎牛血清（熱滅活），15%；L-谷氨酰胺，2mM；雙抗，1%。
2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
二． 細(xì)胞處理：
1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在800-1000RPM條件下離心4-5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，補(bǔ)加培養(yǎng)基至6ml。
2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 將上清取出，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量*培養(yǎng)基終止消化。
3. 輕輕打勻后吸出，和上清一起在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1:5比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

下面T25瓶為類；

1，細(xì)胞凍存時(shí)，取出上清，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml*培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2，4min 1000rpm 離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度1-2xE6/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3，將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
 

注意事項(xiàng)：

1.收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們。

2.收到細(xì)胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時(shí)（視細(xì)胞密度而定）穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收細(xì)胞時(shí)就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細(xì)胞在運(yùn)輸過程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行銷售依據(jù)。

3.由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊懀时竟局槐ＷC客戶收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)，故客戶需要售后時(shí)需出示收到細(xì)胞的時(shí)間證明及客戶提供收貨時(shí)間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時(shí)間證明，期間間隔時(shí)間不能大于7天。

4.大鼠肺泡巨噬細(xì)胞所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。