小鼠成纖維細胞實驗原理及注意事項

小鼠成纖維細胞實驗原理及注意事項：
組織來源：皮下結締組織；疏松結締組織及脂肪
培養條件：MEM +10% FBS
形      態：貼壁；成纖維細胞樣
細胞培養步驟
一．培養基及培養凍存條件準備：
1） 準備培養基；北美胎牛血清，10%；雙抗1%。
2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。
3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。液氮儲存。
二． NCTC clone 929細胞處理：
1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
1. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若NCTC clone 929細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。
2. 按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。
3. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。
小鼠成纖維細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為例；
      1．細胞凍存時，棄去培養基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml*培養基終止消化，可使用血球計數板計數。
      2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至Z終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大于1X106個細胞凍存。
3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
注意事項：
1.        收到NCTC clone 929細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液、渾濁等現象，若有上述現象發生請及時和我們。
2.        先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養箱靜置數小時（4h左右），穩定細胞狀態，切忌在溫箱內靜置過夜。
3.        靜置后鏡檢，拍照，記錄細胞狀態。建議傳代后也拍照記錄細胞生長情況。
4.      貼壁細胞：若細胞密度超過80%，可正常傳代；若未超過80%，收集細胞瓶內的培養基，留8ml繼續培養至80%左右再傳代，瓶蓋可稍微擰松。
5.        細胞瓶內的培養基含血清和雙抗，可收集后4℃保存備用，可補加2%血清。剛開始傳代時建議一半用細胞瓶內的培養基，一半用客戶自備的培養基，使細胞逐漸適應培養條件，以免因不適應而造成生長狀態不佳。
6.        細胞胰酶消化液建議使用PBS配制，
7.        因為細胞培養過程外因太多，所以我們的售后保障期為一周，超過一周的細胞我們會酌情處理，但不提供免費更換服務。
小鼠成纖維細胞運輸和保存：可選擇干冰運輸及發送復蘇存活細胞方式：（1）干冰運輸，收到后立即轉入液氮凍存或直接復蘇；（2）存活細胞，收到后應繼續生長，傳代達到細胞生長狀態良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養步驟。