免疫組化實驗中遇到的問題分析有哪些

       奧運會期間我們課題組研究生都在實驗室做實驗，許多從北京購買的試劑買不到，對我們的許多實驗產生了很大的影響。我以前一直用中杉金橋的Sp三步法染色試劑盒，效果不錯，在奧運會期間我準備做同批實驗分不同批次酶免疫組化實驗，*批組化實驗結果很好，抗體濃度感覺比較合適(Santa Cruz公司1：200)，等做第二批時發現封閉血清不夠了，為了保證實驗順利進行，我又從福州邁新頂了一個SP試劑盒，同時抗體稀釋液也不夠了，我又重新從博士德公司買了一小瓶10ml。從第二批實驗開始，組化實驗結果一直顯示強背景著色，特異性染色很難辨別。

問題及其解答：產生組織切片非特異性染色的原因有哪些?如何解決?

1、 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是Z重要的一條。

2、 一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。

3、內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細胞多的組織)，需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色;

4、 非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果;

5、 DAB孵育時間過長或濃度過高;

6、 PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要;

7、 標本染色過程中經常出現干片，這容易增強非特異性著色。