原代細胞測定周期的方法

一、原理
原代細胞周期指細胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。
單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。
測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。
BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細胞DNA復制的原料，經(jīng)過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上
應表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經(jīng)歷了一個周期，則兩條單體均深染。計
分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器、用品：同常規(guī)原代細胞培養(yǎng)
2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液
三、操作步驟
1、細胞生長至指數(shù)期時，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使Z終濃度為10μg/ml。
2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。
3、48小時后常規(guī)消化細胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。
4、常規(guī)染色體制片（見第三部分：染色體技術）。
5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
6、棄去2×SSC液，流水沖洗。
7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。
8、鏡檢100個分裂相，計、二、三、四細胞期分裂指數(shù)。
9、計算：
原代細胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時）
附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。
（2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉·2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。