分析干細胞復(fù)蘇后貼壁細胞較少的問題

疑問：以前拿回干細胞后，傳代、凍存后復(fù)蘇過幾次都沒什么問題，zui近因?qū)嶒炇曳跸湮廴?，清潔消毒細胞室后，重新?fù)蘇，結(jié)果連續(xù)復(fù)蘇6支，細胞均未貼壁，今晚復(fù)蘇6小時后觀察有一瓶相對貼壁細胞數(shù)較之前復(fù)蘇失敗瓶多，但貼壁細胞狀態(tài)不好，形態(tài)不佳，透光度亦不好!急求各位大俠會診指導!

分析1:復(fù)蘇過程沒有問題，是否是從液氮拿出直接放入溫水，還有培養(yǎng)箱，二氧化碳濃度，培養(yǎng)基、PH值等環(huán)節(jié)。要么加高濃度FBS 15-20%，看看能否幫助貼壁，當然也需要考慮血清問題，還有確信拿來的細胞沒問題。

分析2:首先應(yīng)該懷疑凍存，實際上復(fù)蘇出問題的可能非常小，因為操作簡單，而且死板。

1、你凍存的時候是不是消化的時間過長，這是一般人所注意不到的，即使書上也不講這個問題，但我因為這個問題就兩種肺癌細胞和一種肝癌細胞專門做過試驗，這個是絕大部分人細胞復(fù)不活的一個原因。太長的消化時間會讓細胞復(fù)蘇時失去貼壁能力，表現(xiàn)為先貼后死，原因是在你復(fù)蘇的時候細胞已進入凋亡程序，不可逆轉(zhuǎn)的死亡。

2、你的凍存液好不好，是什么，甘油還是DMSO，質(zhì)量非常重要，否則也會死亡。

3、你的凍存液的量加的是不是太多，ATCC*是不超過7%，大于5%，太多也不好。

4、你在凍存的時候是不是把DMSO混均勻，這個有一些影響，但不算太大。

5、你的凍存是否按部就班，就是所溫度梯度是不是把握嚴格，很多人容易忘卻這個事情，因為這個東西流程長。

6、如果你細胞污染，你是否能很快看到，我比我的導師能早一天看到污染。從這個角度講建議去除離心這步。

7、你的細胞在凍存前是否過密。

還有，不贊成孵箱污染這個概念的，所有在一個孵箱里的細胞都污染一個細菌的話，這個細菌是源于孵箱的，但這不代表孵箱污染，因為孵箱無論你如何處理都有大量的細菌，問題在操作。我們的細胞房不換拖鞋，非常臟，別人的細胞都污染，很多細胞都污染到絕種，但我的只污染一次(兩年內(nèi)只有兩瓶)，那次是因為別人給我動了，我每次干細胞擺放順序都是記住的。如果你老懷疑孵箱污染，那說明你在養(yǎng)細胞這方面很差。

每次污染的原因都要盡可能的找，以后就不犯同樣的問題，這個很重要，不能靠猜，否則你就有可能細胞養(yǎng)絕zui后換課題，這個見得太多了，別不當會事。
進口/國產(chǎn)        *    5克
*    保存：-20℃    無水*    5克
*        *    25克
*        磷酸三鈉    100克
進口/國產(chǎn)        2,2’-聯(lián)喹啉-4,4’-二羧酸鈉    1公斤
*        D(-)酒石酸鈉    5克
*        L(-)酒石酸鈉    25克
*        偏釩酸鈉    0.25毫升
進口/國產(chǎn)    RT    無水偏釩酸鈉    5克
*        四苯硼鈉    25克
*        氟化鈉    100克
*        氫氧化鈉    500克
進口/國產(chǎn)    RT    草酸鈉    1克
*        硫化鈉    25克
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