細(xì)胞凍存的具體操作步驟

    細(xì)胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過程中，在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準(zhǔn)備工作方面都需大量的耗費，而且細(xì)胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細(xì)胞凍存十分必要。細(xì)胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;細(xì)胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。

細(xì)胞凍存的具體操作步驟：

1、配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛血清的凍存培養(yǎng)液;

2、取對數(shù)生長期的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)液，用 PBS 清洗。

3、去除 PBS，加入適量yi蛋白酶 (覆蓋培養(yǎng)皿表面) 把單層生長的細(xì)胞消化下來;

4、離心 1000rpm，5min;

5、去除yi蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為 5×106/ml~1×107/ml;

6、將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管 1~1.5 ml;

7、在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時間及操作者;

8、凍存:標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/ min;當(dāng)溫度達-25℃以下時，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。