PCR反應液的污染消除方法

  PCR是非常靈敏的一項檢測，100個拷貝之內的靶序列就足以產生陽性擴增，從而容易出現DNA污染導致的假陽性。首先，要辨別PCR污染的來源。設立陰陽性對照，有利于檢測反應體系各成分的污染情況。尤其是設立空白對照，即包括PCR的全部組分，而不加模板DNA，這對檢測試劑中PCR產物殘留污染是非常有益的。

  在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發現試劑被污染了，則考慮可能為環境污染。環境污染的最主要原因是DNA溶液的濺出和DNA氣溶膠造成的實驗區域的污染，這尤其在PCR產物擴增區容易出現。移液器槍頭和EP管架是也較常見的污染部位。

  如果是環境污染，還可對每個區域進行涂抹采樣和核酸提取，以最終鑒定污染的區域所在。

  對于PCR反應液的污染，可采取以下方法：

1、DNase I 法：

PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應30min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。

2.、內切酶法：

選擇識別4個堿基的內切酶（如MspI和TaqI等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h后加熱滅活進行PCR。

3、紫外照射法：

未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進行紫外照射，注意事項與方法同上述UV照射法。

4、尿嘧ding 糖苷酶（UNG）法：

用dUTP代替dTTP，使PCR產物中摻入大量dU。在再次進行PCR擴增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產物的殘留污染。由于UNG在PCR循環中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR產物。