流式細(xì)胞術(shù)（FCM）知識(shí)小課堂

FCM是利用流式細(xì)胞儀對(duì)處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分析技術(shù)。然而，在FCM的實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，要想得到高質(zhì)量的流式數(shù)據(jù)卻并非易事。現(xiàn)就FCM實(shí)驗(yàn)中的常見(jiàn)問(wèn)題進(jìn)行分析，希望能幫助相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員提高實(shí)驗(yàn)成功率。

1. 怎么選擇合適的對(duì)照？
   1）同型對(duì)照：使用同型抗體做平行實(shí)驗(yàn)，主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結(jié)合。
   2）陰性細(xì)胞對(duì)照：使用已知的不表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞做平行實(shí)驗(yàn)，主要目的是消除抗體的非特異性結(jié)合。
   3）二抗對(duì)照：第二抗體多為熒光標(biāo)記的多抗，非特異性結(jié)合一般較高，可能造成基礎(chǔ)熒光值偏高，設(shè)立二抗對(duì)照平行實(shí)驗(yàn)的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著色。
   4）陽(yáng)性對(duì)照：一般會(huì)使用已知的高表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞做平行實(shí)驗(yàn)，主要目的是排除實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)方法、試劑、操作等實(shí)驗(yàn)的影響因素。
   5）空白對(duì)照：不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞，主要目的是用于測(cè)定基礎(chǔ)熒光信號(hào)表達(dá)值。

2. 收集的細(xì)胞通過(guò)流式儀檢測(cè)時(shí)，一般多少的細(xì)胞量合適？
   進(jìn)行流式檢測(cè)時(shí)，至少需要記錄5000個(gè)活細(xì)胞，一般調(diào)整細(xì)胞密度至1*106/100ul進(jìn)行流式檢測(cè)。

3. FCM檢測(cè)過(guò)程中如何設(shè)門（gating）？
   一般根據(jù)散射光進(jìn)行設(shè)門，即我們通常所說(shuō)的前散（forward scatter, FSC）和側(cè)散（side scatter, SSC）來(lái)設(shè)門。FSC的大小與細(xì)胞的直徑成正相關(guān)，不同的細(xì)胞，細(xì)胞越大，其FSC越大；反之越小。SSC的大小與細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)的質(zhì)量成正相關(guān)，不同的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，質(zhì)量越大，其SSC越大；反之越小。

4. FCM檢測(cè)過(guò)程中如何調(diào)節(jié)補(bǔ)償？
   在FCM檢測(cè)過(guò)程中，如果存在多色，則必須進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)補(bǔ)償首先要知道雙陰性細(xì)胞的情況，其次，必須要用單陽(yáng)和雙陰性細(xì)胞。只有在有陰性細(xì)胞作為參照的情況下，才能既不會(huì)過(guò)多又不會(huì)過(guò)少地調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

5. FCM檢測(cè)時(shí)，每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)一定要相同嗎？
   FCM檢測(cè)時(shí)，若不進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)而憑感覺(jué)隨意進(jìn)行實(shí)驗(yàn)會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)細(xì)胞量多而抗體量不變或細(xì)胞量不變而抗體量減少，那么熒光抗體平均分布到每個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞上的量就會(huì)相對(duì)減少。由此可見(jiàn)，不同的細(xì)胞量會(huì)影響最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，在準(zhǔn)備樣本時(shí)，必須進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使每個(gè)分組及每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)保持一致。

6. FCM檢測(cè)時(shí)，如果存在多色分析，應(yīng)該如何進(jìn)行配色呢？
   在FCM檢測(cè)過(guò)程中，如果存在多色分析，雖然可以通過(guò)熒光補(bǔ)償來(lái)消除熒光光譜重疊的影響。但調(diào)節(jié)補(bǔ)償過(guò)大在一定程度上仍然會(huì)影響測(cè)值的準(zhǔn)確性，因此，我們一般建議盡量選擇熒光光譜重疊少的熒光抗體組合。