?Real-Time qPCR常見問題解析

1.無Ct值出現(xiàn)

1）、 檢測熒光信號的步驟有誤: 一般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。

2）、 引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性。

3）、 模板量不足: 對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

4）、 模板降解: 避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。

2. Ct值出現(xiàn)過晚（Ct>38）

1）、 擴(kuò)增效率低: 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。

2）、 PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。

3）、 PCR產(chǎn)物太長: 一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。

3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳

1）、加樣存在誤差: 使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。

2）、 標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解: 應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

3）、 引物或探針不佳: 重新設(shè)計更好的引物和探針。

4）、 模板中存在抑制物，或模板濃度過高

4. 負(fù)對照有信號

1）、 引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

2）、 引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

3）、 鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。

4）、 模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴(kuò)增。

5. 溶解曲線不止一個主峰

1）、引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

2）、 引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

3）、 鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。

4）、 模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴(kuò)增。

6. 擴(kuò)增效率低

1）、 反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

2）、 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。

3）、反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。

7. 同一試劑在不同儀器上產(chǎn)生不同的曲線，如何判斷？

判斷標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)增效率，靈敏度，特異性

如果擴(kuò)增效率在90%-110%，都是特異性擴(kuò)增，都可以把數(shù)據(jù)用于分析。

8. 擴(kuò)增曲線的異常？比如“S"型曲線？

1）、 參比染料設(shè)定不正確(MasterMix不加參比染料時，選NONE)

2）、模板的濃度太高或者降解

3 ）、熒光染料的降解