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    分享---測培養細胞中污染的支原體

    時間:2013/9/2閱讀:1420
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    PCR法
    原理 該法是通過PCR技術將支原體16srRNA基因特異性擴增,來檢測培養細胞中污染的支原體。PCR引物選自16sr RNA基因上的支原體特異片段,此片段與其他細菌的序列無交叉性雜交反應。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳,經溴乙啶(EB)染色后在紫外透射儀上進行檢測。
    u  16sr DNA引物用水稀釋至40umol/L。
    (1).正向引物:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’
    (2).反向引物:5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’
    2)  PCR擴增
    (1)  在冰浴中對各樣品制備PCR重要混合物,對每個樣品均加入:
    10X PCR緩沖液 5.0ml
    25mmol/L dNTPs 混合物 0.4ul
    40umol/L 16sr DNA引物 每種引物1.0ul
    40umol/L pBR322 DNA 引物 每種 2.0ul
    pBR322 DNA 1pg/ml 2.0ul
    DNA聚合酶(5U/ml) 0.2ul
    三蒸水 35.4ul
    總量 45ul
    (2)  用無菌去離子水稀釋樣品為1:10,1:100。
    (3)  于每個eppendorf管中加45ul PCR擴增混合物,每管中分別加入樣品原液及1:10,1:100稀釋液各5ul,操作均在冰浴中進行。
    (4)  在每個eppendorf管中輕輕加入50ul無菌礦物油,覆蓋在液面上。如DNA擴增儀帶有有制式熱蓋,此步驟可省略。
    (5)  將各管放入DNA擴增儀的孔槽內,并執行以下循環指令:
    ①  950C 10min 一個循環
    ②  950C,30S→580C 1min→720C 1min, 共30個循環。
    ③  zui后720C 10min延長循環。

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