噬菌體DNA/RNA結合性篩選的標準程序

A.噬菌體的制備
1．將新鮮的或冰凍保存在細菌中的文庫儲液（實驗方案9．2）轉接入200m1含有15ug/m1 的四環素的2×TY培養基中。我們通常轉接超過文庫容量約10倍數目的有活性的細菌細胞，以確保文庫的多樣性得以保持?？梢酝ㄟ^把一系列的稀釋液涂布在合適的平板上培養的方法，測定凍存液中有活性細胞的濃度。
2．以250r/min的速度振蕩菌液，30℃培養16小時。
3．3700g離心過夜培養的菌液15分鐘，以制備噬菌體上清液。取出并保留上清液，于4℃保存。滴定上清液。

B．篩選
1．合成需要的靶標DNA或RNA寡核苷酸，其中一組是5’端連接*的寡核苷酸鏈。為dsDNA位點合成一條不聯結*的互補副鏈。
2．①對于DNA位點的篩選，將每條寡核苷酸鏈各取10u1，與20/A1的2X核酸退火緩沖液混勻，讓兩條互補的寡核苷酸退火。在PCR儀中以94℃加熱樣品3分鐘，然后以每分鐘2℃的速度冷卻至4℃。冷卻后，用水將溶液稀釋至1pmol/L的終濃度，于-20℃保存。②對于RNA位點篩選，用RNA折疊緩沖液（1XCM）配制1pm01/L的寡核苷酸溶液。將溶液加熱至95℃，然后緩慢冷卻至室溫，以使RNA折疊。對于有些位點，“突然”冷卻至4℃可能折疊效果更好。將RNA溶液保存在4℃（雖然有些位點能成功地冰凍—解凍）。
3．將*聯結的靶標位點（通常是1pmol）加入50,ulPBS緩沖液，加入到鏈親和素包被的小管內。將小管于20℃放置15分鐘。 。
4．將1m1含4％（w/v）脫脂牛奶的PBS緩沖液加入小管，以封閉非特異性結合位點。將小管于20℃放置1小時。
5，將噬菌體上清液以1：10稀釋于1ml含有2％（w/v）脫脂牛奶、1％（體積分數）Tween-20及20ug /ml超聲破碎鮭魚精DNA的PBS緩沖液中。為了提高篩選的特異性，加入與靶標同源的寡核苷酸競爭劑。加入與*聯結的靶標相比過量達100倍的競爭劑。
6，棄去核酸包被的小管中的封閉緩沖液，加入1ml稀釋過的噬菌體上清液。小管于20℃放置1小時。
7．將結合混合物棄去，用含2％（w/v）脫脂牛奶和l％（體積分數）Tween—20的PBS緩沖液洗滌20次，再用PBS緩沖液單獨洗滌一次。
8，加入100/A1 0．1m01/L的三乙醇胺并放置15秒，以洗脫保留的噬菌體。將溶液轉入一個新的小管中，并立即用等體積的1mol/LTris—HCl（pH 7．4）進行中和。
9．將過夜培養的菌液以1：100接種于2×TY培養基中，37℃培養約2小時以制備處于對數生長期的大腸桿菌TGl菌液。菌種必須源于M9小化瓊脂培養基平板上生長的克隆，這樣才能保證F，纖毛的表達，因為這是噬菌體感染所必需的。
10．用50ul洗脫的噬菌體感染0．3m1處于對數生長期的大腸桿菌TGl菌液，混勻后37℃靜置培養1小時。
11．將感染過的菌液轉入2～5ml含有15/Ig/m1的四環素的2XTY培養基中。 以250r/min的速度振蕩菌液，30℃培養16小時，為隨后幾輪的篩選制備噬菌體。
12．重復從步驟2或3到步驟12的篩選程序3～5輪。在后一輪篩選后，將感染的細菌 涂布在含15ug/m1的四環素的TYE瓊脂培養基平板上。這時篩選出的克隆已準備好，可用于通過序列測定和ELISA進行的進一步的鑒定。