構(gòu)建輕鏈改組文庫

為便于輕鏈改組，要在FHENl—Vλ3載體中構(gòu)建輕鏈基因文庫。此載體以pHEN1為基礎(chǔ)并包含：pelB前導(dǎo)序列、1個(gè)NcoI克隆位點(diǎn)、1個(gè)多接頭、1個(gè)編碼VH框架4中2個(gè)C末端氨基酸的XhoI克隆位點(diǎn)、接頭DNA以及1個(gè)單條Vλ輕鏈。XhoI位點(diǎn)可編碼于VHFR4末端，但不會(huì)改變102和103（*—*）殘基的氨基酸序列。為了文庫構(gòu)建，采用PCR擴(kuò)增Vκ和Vλ基因文庫以及接頭DNA。所用模板來自同樣的文庫容為1．8Χ108的scFv噬菌體抗體文庫。使用4個(gè)反向引物；它可以互補(bǔ)結(jié)合（G1y4Ser），接頭起始的6個(gè)核苷酸和JH1，2、JH3、JH4，5或JH6片段中任何1個(gè)，并含有XhoI克隆位點(diǎn)。用XhoI和NotI消化pHENl—Vλ3載體，除去單個(gè)的Vλ3基因，并將擴(kuò)增的基因文庫克隆到消化的載體中。
終所產(chǎn)生的基因文庫包含重排的人Vκ和Vλ基因文庫、接頭DNA以及1個(gè)作為NcoI—XhoI片段插入重排VH基因的克隆位點(diǎn)。

用改組的VL鏈構(gòu)建scFv基因文庫的策略。
（a）用PCR在載體pHENl中構(gòu)建輕鏈文庫。（b）再將作為Nco I—XhoI片段的重排VH基因插入．構(gòu)建VL改組文庫
為創(chuàng)建輕鏈改組文庫，以PCR擴(kuò)增來自起始scFv的重排VH基因，引物采用互補(bǔ)結(jié)合VH基因上游的BACK引物以及互補(bǔ)結(jié)合目標(biāo)scFv的JH基因。載體pHENl中scPv基因的構(gòu)建過程中分別使用了引物I-MB3和引物scFvJHXho—FOR中的1條。LMB3互補(bǔ)結(jié)合pHENl中PelB前導(dǎo)序列上游，scFVJHXhoFOR互補(bǔ)結(jié)合目標(biāo)scFv的JH基因。下面所述的試劑部分列出的4條ＪHFOR引物中應(yīng)有一條與特定的scFvVH基因*匹配，這也正是應(yīng)當(dāng)使用的FOR引物。如果起始scFv的克隆載體不足pHENl而是其他的，那么需要一條不同的5’端引物。