人VL基因文庫的構(gòu)建

[方法]
1．配制4個(gè)獨(dú)立的50ul PCR反應(yīng)混合液， 包含：
● 水，35．5ul
● 20XdNTP（每種5mmol／L），2．5ul
● 10XVent聚合酶緩沖液，5．0ul
● FdSEQl引物 （10pmol/u1），2．5ul
● 反向引物（10pmol/u1），2．5ul
● 單鏈scFv模板DNA（10ng），1．0ul
● Vent DNA聚合酶（2單位），1．0ul
2．在有加熱蓋的熱循環(huán)儀內(nèi)加熱反應(yīng)混合液到94℃5分鐘。
3.以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分鐘的條件共循環(huán)25次，擴(kuò)增VL基因。
4．用Wizard PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。
5．用XhoI和NotI消化PCR產(chǎn)物；但除了用XhoI替代 NcoI，還需用NEB2緩沖液和BSA，按照廠家要求進(jìn)行。
6．用XhoI和NotI消化pHENl—VL3載體DNA；但不要用XhoI替代NcoI。
7．連接已消化的PCR產(chǎn)物和已消化的載體，并電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGl細(xì)胞中，構(gòu)建4個(gè)VL基因噬菌體文庫。測(cè)定文庫容量并將細(xì)菌性文庫材料儲(chǔ)存于-70℃。
8．用含甘油文庫儲(chǔ)存材料細(xì)菌接種到含100ug／ml氨芐*和1％葡萄糖的100ml 2X TY培養(yǎng)基中，制備每種VL基因文庫DNA。接種量應(yīng)足夠大以保證接種細(xì)菌數(shù)至少比文庫容量大5倍。過夜培養(yǎng)后，按標(biāo)準(zhǔn)的DNA質(zhì)粒制備方法進(jìn)行操作。為了續(xù)后進(jìn)行文庫消化，可合并不同文庫的DNA。