在固相抗原上選擇噬菌體抗體

1．用溶于PBS的2m1抗原（10—1000ug/m1） 包被免疫管，室溫過夜。碳酸鹽緩沖液也可使用。
2．用PBS洗滌試管3次，并用2％MPBS封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，放在旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)臺(tái)上，37℃l小時(shí)。
3．用PBS洗滌試管3次；加入lml滴度為10lz～1013的噬菌體抗體（稀釋于lml 4％MPBS中），在旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)臺(tái)上孵育30分鐘，再靜止1．5小時(shí)。
4．用PBS/PBS/Tween洗滌試管1次，并用PBS洗滌2次。每次洗滌是將緩沖液倒入和倒出試管。
5．加入1．Oml 100mmol/L三乙基胺，給試管加蓋，然后再轉(zhuǎn)臺(tái)上轉(zhuǎn)動(dòng)8分鐘。
6．將洗脫液轉(zhuǎn)移至1個(gè)新試管中，并立即加入0．5mllmol/LTris—HCl（pH 7．4） 中和并混勻。
7．將一半體積的洗脫液（0．75m1）加入到10m1對(duì)數(shù)生長的大腸桿菌TGl或DH5αF，（A600值為0．5）中；37℃孵育培養(yǎng)液30分鐘，不用振蕩。
8．取1P1培養(yǎng)液在100mmTYE/amp/glu平板上鋪板以滴定洗脫的噬菌體。
9．以4000r/minl5分鐘離心剩余的培養(yǎng)液。重懸于0．5ml 2XTY培養(yǎng)基中，并在兩塊150mmTYE/amp/glu平板上鋪板。
10．準(zhǔn)備下一輪選擇所需的噬菌粒顆粒：感染輔助噬菌體，但要將起始培養(yǎng)體積降至10m1（步驟1），并擴(kuò)充培養(yǎng)體積至50ml。由于體積變小，可用臺(tái)式離心機(jī)操作。將噬茵體重懸于終體積為1．Oml的PBS中，并用大腸桿菌TGl測(cè)定噬菌體滴度。
11．從步驟1開始，重復(fù)進(jìn)行選擇，共2～4輪。*輪過后，要增加洗滌的嚴(yán)謹(jǐn)性：洗脫前，用PBS/Tween洗滌20次并用PBS洗滌20；hQ。用PBS和PBS/Tween進(jìn)行一次或兩次時(shí)間為30分鐘的洗滌步驟，也能提高嚴(yán)謹(jǐn)性。