蛋白鹽析實驗步驟及注意事項

一、實驗步驟：

       蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、*、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應(yīng)用zui多的硫酸銨，由下表可以看出：它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度大（20度時飽和溶液為754克/升；0度時飽和溶解度為706克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當(dāng)用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。

表1 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）

 0℃
 20℃
 80℃
 100 ℃

 
（NH4）2SO4
 70.6
 75.4
 95.3
 103
 
Na2SO4
 4.9
 18.9
 43.3
 42.2
 
NaH2PO4
 1.6

 7.8

 93.8

 101

飽和硫酸銨法：
1. 取x ml血清加x ml生理鹽水，于攪拌下逐滴加入2xml飽和硫酸銨，硫酸銨的終飽和度為50%。
2.  4℃，3h以上，使其充分沉淀離心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理鹽水溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。
3. 置4℃3h以上，[此時，（NH4）2SO4的飽和度為33%]重復(fù)上述第二步過程1～2次。末次離心后所得沉淀物為蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml裝入透析袋。
4. 對PBS充分透析、換液3次，至萘氏試劑測透析外液無黃色，即無NH4+為止。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。

二、注意事項：

1. 鹽析的成敗決定于溶液的pH值與離子強度，溶液pH值越接近蛋白的等電點，蛋白質(zhì)越容易沉淀。
2. 鹽析一般用的硫酸銨，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平鋪放入烤箱內(nèi)60攝氏度烘干后再稱量，這樣更準確。
3. 在加入鹽時應(yīng)該緩慢均勻，攪拌也要緩慢，越到后來速度應(yīng)該更注意緩慢，如果出現(xiàn)一些未溶解的鹽，應(yīng)該等其*溶解后再加鹽，以免引起局部的鹽濃度過高，導(dǎo)致酶失活。
4. 鹽析后攪拌40分鐘到一個小時而且再在冰浴中放置一段時間。3.5為了避免鹽對酶的影響，一般脫鹽處理后再測酶活性。
5. 鹽析后的蛋白質(zhì)盡快脫鹽處理，以免變性，透析較慢，一般可用超濾或者G-25，G-50 處理。
6. 一般粗提物蛋白*沉淀是在硫酸銨濃度在70%左右。