影響外源基因在巴氏畢赤酵母中表達的因素

摘要 要在一種宿主表達系統中成功表達外源蛋白并獲得較高產量，必須要較為全面地了解影響其表達的諸多因素。影響外源基因在巴氏畢赤酵母中表達的因素主要包括：外源基因的特性、表達框的染色體整合位點和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因劑量、分泌信號、產物穩定性和翻譯后修飾等。本文就這些因素進行分析，并提出一定的對策和建議。

酵母菌是單細胞真核生物，具有生長快、易于遺傳操作、能對外源蛋白進行翻譯后加工和修飾、不產生有毒產物等特點，被認為是表達外源蛋白的合適宿主。幾種工業酵母尤其是巴氏畢赤酵母（pichia pastoris, Pp），因具有旺盛的生長力以及其它一些*的性質，已發展成為較成熟的蛋白生產的表達系統。已有許多細菌、真菌和高等動植物的基因在Pp中成功表達（如破傷風毒素片段Ｃ，12g/L），但也有許多蛋白的表達量并不理想（如多瘤病毒大T抗原，0.5mg/L），甚至不能表達（如HIV表面糖蛋白）。另外，酵母表達系統的局限性還在于分泌產物的不均一性，包括聚合體的存在、信號肽加工不*以及內部降解等現象。所有這些都提醒我們在Pp中表達外源蛋白時，應周密考慮影響其表達的各個因素。

1、外源基因特性
外源基因在Pp中表達時，其自身就是影響表達水平的重要因素。不同的培養基配方、發酵參數和飼養方案主要是通過提高細胞總數而并非單個細胞產率來提高外源蛋白的產量。Fahnestock等發現隨著外源的蛛牽拉絲蛋白基因拷貝數的增加，其生產效率會相對有所降低。另外，許多高A+T含量的基因常會由于提前終止而不能有效轉錄引;不合適的mRNA5\\'非翻譯區的核苛酸序列和長度也可能會便基因的表達不盡如人意。提前終止被認為是一種具有種屬特異性的現象，譬如在Pp中不能表達的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中卻表達良好。因此，可以通過調整高A+T含量區的核甘酸組成來避免提前終止的發生。而Sreekrishna等通過調整人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的mRNA5\\'非翻譯區與醇氧化酶（alcohol oxidase 1，AOX1）的5\\'非翻譯區相同后，HSA的表達量可以提高50倍以上。但遺憾的是，限于目前對Pp的了解程度，仍然無法預見某種外源蛋白是否能在其中獲得高產甚至僅僅能否表達。至僅僅能否表達。

2、表達框的染色體整合位點和方式
　　雖然相對于自主復制載體來講，整合性載體的轉化率較低，但由于Pp沒有天然質粒，所以設計表達載體偏向于染色體整合，通過同源重組，載體整合到細胞染色體中間。整合性載體具有表達框穩定和可控制整合位點等*性，并且能夠發生多位點整合而獲得多拷貝。
AOXl和*脫氫酶（histidinol dehydrogenase , HIS4）基因位點都已被成功用于表達外源蛋白。Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表達框偶有缺失。這種缺失源于表達框中his4染色體突變拷貝與完好的his4基因的基因轉換。因此，看起來aox1位點是較為理想的位點。

3、宿主菌的甲醇利用表型（Mut＋和MutＳ）
　　用末端與aox1基因5\\'和3\\'端同源的線性DNA轉化Pp HIS4菌株可導致Mx1結構基因的特異性剔除。aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培養基上生長緩慢（methanol utilization slow , MutＳ或Mut-），它們只能利用弱的aox2基因啟動合成aox2基因啟動合成AOX；而aox1基因完整的酵母則生長正常（Mut＋）。原則上，如果是胞內表達，應盡量用Mut－細胞，這樣得到的蛋白產物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對較多（約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰*酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進行。當誘導AOX1時，轉化子不能同時高水平產生酒精氧化酶和外源蛋白，與野生型Mut＋比較，Mut－細胞對氧的要求亦較低，生長也較慢。為解決這個問題，Jeffrey等用甲醇加甘油混合飼養，得到了255mg/L的CD40配體（CD40L）。但由于甘油可部分阻遏aoxl啟動子，蛋白表達可能并不處于*水平。Sreekrishna等zui近運用*和甲醇混合批量飼養發酵，在不到4個星期的時間里，他們用一個4L的發酵罐連續完成了幾個周期的生產。在這種發酵方式中，大部分碳源由*提供，減少了總的甲醇消耗，因而效率大大提高。
zui近，一種無需甲醇誘導而能組成性表達外源蛋白的畢赤酵母載體pCAPZ和pGAPZa已經構建成功，組成性表達的蛋白量與該蛋白對酵母菌的毒性有關。研究發現它們常能生產比誘導型載體pPICZ和pPICZa更高的外源蛋白。這些載體均利用了編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因的啟動子。Doring等分別用pGAPZB和pPICZB來生產兔腎肽轉運蛋白（rPEPT2）以及人小腸肽轉運蛋白（hPEPT2）,結果發現，前者表達的此兩種蛋白的產量均比后者高4倍?？磥碓谏a哺乳動物膜轉運蛋白時，pGAP比pAOX1更理想。