NADP-蘋果酸脫氫酶試劑盒的操作方法

NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-malate dehydrogenase, NADP-MDH）

試劑盒說明書

測(cè)定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細(xì)胞多種生理活動(dòng)中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH， NADP-MDH主要存在于真核細(xì)胞中。

測(cè)定原理：

NADP-MDH催化NADPH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一、提取液60 mL×1瓶，在4℃保存；

試劑二、液體50 mL×1瓶，在4℃保存；

試劑三、粉劑×2支，-20℃保存；臨用前加入300μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存；

試劑四、粉劑×2支，-20℃保存；臨用前加入300μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存。

樣本測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備 ： 

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，棄上清，按照每200萬細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作表：

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，混勻后在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種），340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應(yīng)1min后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意事項(xiàng)：

1、粗酶液的提取必須在0℃ - 4℃中操做完成，以防止酶變性失活。

2、實(shí)驗(yàn)時(shí)，試劑三、試劑四和樣本在冰上放置，以免變性和失活。試劑二37℃或25℃室溫放置。

NADP-MDH活力單位的計(jì)算：

1、血清（漿）NADP-MDH活力的計(jì)算

單位的定義：每升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 μmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。 

NADP-MDH（U/L）=反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（20μL）÷反應(yīng)時(shí)間(1min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10-3）×ΔA= 6430 ×ΔA 

2、組織中NADP-MDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（U/mg prot）=反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（20μL）÷反應(yīng)時(shí)間(1min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10-3）×ΔA÷蛋白濃度（mg/mL）= 6430 × ΔA ÷蛋白濃度（mg/mL）

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（U/g 鮮重）=反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（20μL）÷反應(yīng)時(shí)間(1min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10-3）×ΔA÷樣本鮮重（g/mL）=6430 × ΔA ÷樣本鮮重（g/mL）

3細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞中NADP-MDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（U/mg prot）=反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（20μL）÷反應(yīng)時(shí)間(1min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10-3）×ΔA÷蛋白濃度（mg/mL）= 6430 × ΔA ÷蛋白濃度（mg/mL）

（2）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（U/104 cell）=反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（20μL）÷反應(yīng)時(shí)間(1min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10-3）×ΔA÷細(xì)菌或細(xì)胞密度（104/mL）=6430 × ΔA ÷細(xì)菌或細(xì)胞密度（104/mL）