大鼠原代細胞（Primary cells）分離培養實驗步驟

     原代細胞（Primary cells）是指直接從機體取出的組織或細胞獲得單個細胞并在體外進行培養的細胞。組織主要指組織器官、外周血及胚胎等。由于原代細胞生長緩慢，繁殖一定的代數停止生長（一般10代以內）。

實驗步驟：
1.取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。
2.在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養皿中，去除小腦和間腦。
3.將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養皿中。
4.用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。
5.大腦皮質放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。
6.室溫1 000×g離心8min，去上清液。
7.沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。
8.沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。
9.沉淀加入2ml DMEM培養液懸浮混勻，鋪于經離心形成連續梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。
10.靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM
漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。
加入DMEM全培養液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養皿中，置于37℃、5％CO2培養箱內靜置培養24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養基，隨后隔天換液。