PCR引物設計和選擇遵循原則

  PCR反應產物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵。引物設計和選擇目的DNA序列區域時可遵循下列原則：

1、 引物長度約為16-30 bp， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費，且難以合成。

2、引物中G+C含量通常為40%-60%，可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。

3、四種堿基應隨機分布，在3'端不存在連續3個G或C，因這樣易導致錯誤引發。

4、引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應， 以減少由于密碼子擺動產生的不配對。

5、在引物內， 尤其在3'端應不存在二級結構。

6、兩引物之間尤其在3'端不能互補， 以防出現引物二聚體， 減少產量。兩引物間最好不存在4個連續堿基的同源性或互補性。

7、引物5'端對擴增特異性影響不大， 可在引物設計時加上限制酶位點、核糖 體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物su、熒光素、di高辛等。通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。

8、引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產物本身無穩定的二級結構， 以免產生非特異性擴增，影響產量。

9、簡并引物應選用簡并程度低的密碼子， 例如選用只有一種密碼子的Met， 3'端應不存在簡并性。否則可能由于產量低而看不見擴增產物。

10、一般PCR反應中的引物終濃度為0.2-1.0 μmol/L。引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚體， 過低則降低產量。利用紫外分光光度計， 可精確計算引物濃度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物濃度可按下式計算：

X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)

X： 引物摩爾濃度，A、C、G、T：引物中4種不同堿基個數。