細(xì)胞冷凍保存步驟及注意要點(diǎn)

細(xì)胞冷凍保存

步驟：

1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。
2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10％，混合均勻，置于室溫下待用。
3. 按細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液((約0.1 ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5x106cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中1ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。
5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16～18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于含異丙醇的程序降溫盒中，直接放入-80℃，1～2天后再放入液氮槽中。

注意事項(xiàng)：

1. 欲冷凍保存的細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度。
2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞仍保有其*性質(zhì)。
3.冷凍保護(hù)劑DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無菌且無色，以5~10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。
4. 冷凍保護(hù)劑濃度為5或10%DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。