【儀表網(wǎng) 儀表產(chǎn)業(yè)】2019年12月3日，Journal of Biological Chemistry 雜志在線發(fā)表了中國科學(xué)院生物物理研究所周政課題組與美國克利夫蘭Lerner Research Institute 的Zihua Gong課題組合作完成的研究論文“Structural basis for shieldin complex subunit 3–mediated recruitment of the checkpoint protein REV7 during DNA double-strand break repair”。該項(xiàng)研究詳盡揭露SHLD3蛋白招募REV7的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對進(jìn)一步了解細(xì)胞的DSB修復(fù)通路調(diào)控過程具有重要意義。
DNA雙鏈斷裂(DNA Double Strand Break，DSB)是極為嚴(yán)重的DNA損傷形式，如未被及時(shí)修復(fù)它將導(dǎo)致細(xì)胞癌變或死亡等嚴(yán)重后果。在脊椎動(dòng)物中，有兩種保守的修復(fù)途徑被用來處理這些具有毒性的DNA斷裂末端，從而確保基因組遺傳信息的穩(wěn)定：非同源末端連接(NHEJ，non-homologous end-joining)，以及同源重組(HR，homologous recombination)。
非同源末端連接(Non-homologous End Joining-NHEJ)是真核生物細(xì)胞在不依賴DNA同源性的情況下，而為了避免DNA或染色體斷裂(Breaks)的滯留，避免因此造成的DNA降解或?qū)ιΦ挠绊懀瑥?qiáng)行將兩個(gè)DNA斷端彼此連接在一起的一種特殊的DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制。
同源重組(Homologous Recombination) 是指發(fā)生在非姐妹染色單體(sister chromatid) 之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。同源重組需要一系列的蛋白質(zhì)催化，如原核生物細(xì)胞內(nèi)的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物細(xì)胞內(nèi)的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重組反應(yīng)通常根據(jù)交叉分子或Holliday結(jié)構(gòu)(Holliday Juncture Structure) 的形成和拆分分為三個(gè)階段，即前聯(lián)會體階段、聯(lián)會體形成和Holliday 結(jié)構(gòu)的拆分。
選擇何種途徑來實(shí)現(xiàn)對DSB的修復(fù)在細(xì)胞中是受到嚴(yán)密調(diào)控的，此過程涉及多種因素的影響，諸如細(xì)胞周期、表觀遺傳調(diào)控與DNA末端切除機(jī)制等。Shieldin是近期新鑒定出來的具有四個(gè)亞基的復(fù)合物。它是53BP1的下游效應(yīng)因子，可直接結(jié)合ssDNA末端、抑制DNA末端酶切，進(jìn)而促進(jìn)NHEJ修復(fù)途徑。SHLD3是復(fù)合物中上游的因子，其與REV7組成了Shieldin中的“DSB定位模塊”，對于損傷發(fā)生后復(fù)合物的定位非常關(guān)鍵。但人們對SHLD3如何招募REV7并發(fā)揮功能這一過程并不清楚。
DNA酶切是指限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性。
在這項(xiàng)研究中，研究人員解析了SHLD3-REV7復(fù)合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)顯示SHLD3的REV7結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)采用一種“長柄勺”狀結(jié)構(gòu)來識別REV7蛋白，并且依據(jù)二級結(jié)構(gòu)特性，RBD又可以分為N端和C端兩個(gè)部分。其中，N端的無規(guī)卷曲充當(dāng)“勺”的柄而C端的α螺旋結(jié)構(gòu)則充當(dāng)了“勺”的底座。
無規(guī)卷曲是蛋白質(zhì)肽鏈中沒有規(guī)律的那部分肽段構(gòu)象。其結(jié)構(gòu)比較松散，與α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角比較起來沒有確定規(guī)律，但是對于一些蛋白質(zhì)分子無規(guī)卷曲特定構(gòu)象是不能被破壞的，否則影響整體分子構(gòu)象和活性。無規(guī)卷曲(random coil)或卷曲(coil)，它泛指那些不能被歸入明確的二級結(jié)構(gòu)如明確的二級結(jié)構(gòu)如折疊片或螺旋的多肽區(qū)段。這些“無規(guī)卷曲”有明確而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。它們受側(cè)鏈相互作用的影響很大。這類有序的非重復(fù)性結(jié)構(gòu)經(jīng)常構(gòu)成酶活性部位和其他蛋白質(zhì)特異的功能部位。
通過生物化學(xué)和生物物理學(xué)等多種方法，研究人員證明了SHLD3-RBD 的N端和C端兩部分對于其與 REV7 的緊密結(jié)合是不可少的。另外，通過表面等離子共振實(shí)驗(yàn)，該研究從動(dòng)力學(xué)角度揭示了REV7獨(dú)特的“安全帶”結(jié)構(gòu)對于SHLD3的相互作用十分重要，因?yàn)檫@種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)能夠延緩SHLD3-RBD 從REV7上解離的過程，使二者形成的復(fù) 合物能夠更加穩(wěn)定的存在。總的來說，該項(xiàng)研究工作揭示了SHLD3-REV7 異源二聚體間相互作用的分子機(jī)制，為深入了解整個(gè)Shieldin 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系奠定了基礎(chǔ)。
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