【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)是研究納米尺度生物分子動(dòng)態(tài)和相互作用的前沿生物物理工具。傳統(tǒng)的長(zhǎng)時(shí)間單分子FRET測(cè)量通常依賴于全內(nèi)反射熒光(TIRF)顯微鏡，通過(guò)追蹤單個(gè)熒光分子的強(qiáng)度變化，揭示分子層面的動(dòng)態(tài)信息。然而，這一過(guò)程產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)據(jù)分析和篩選提出了挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的人工或半自動(dòng)化方法不僅效率低下，而且容易引入主觀偏差，嚴(yán)重依賴于實(shí)驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)。深度學(xué)習(xí)模型的應(yīng)用則極大地減少了人為錯(cuò)誤，提高了數(shù)據(jù)處理的速度和準(zhǔn)確性。盡管如此，現(xiàn)有的深度學(xué)習(xí)模型往往難以根據(jù)用戶的特定需求進(jìn)行優(yōu)化。
10月28日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心陳春來(lái)課題組在《通訊·生物學(xué)》(Communications Biology)雜志發(fā)表了題為“基于深度學(xué)習(xí)和局部特征的單分子熒光事件自動(dòng)識(shí)別方法”(Deep learning based local feature classification to automatically identify single molecule fluorescence events)的論文，介紹了一種名為DEBRIS(Deep lEarning Based fRagmentatIon approach for Single-molecule fluorescence event identification)的新方法，專注于對(duì)單分子熒光軌跡的局部特征進(jìn)行分類。通過(guò)調(diào)整用戶定義的標(biāo)準(zhǔn)，DEBRIS能夠利用同一AI模型，精確篩選和分析四種不同類型的單分子熒光事件。
DEBRIS的核心理念在于，所有長(zhǎng)時(shí)間尺度的單分子軌跡都是由有限類型的包含特定局部特征的短片段構(gòu)建而成的。類似于俄羅斯方塊中，有限的積木類型可以拼接出多種多樣的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。DEBRIS模型中包含七個(gè)類別的雙通道短片段強(qiáng)度-時(shí)間跡線，以模擬單分子雙色熒光實(shí)驗(yàn)中常見的局部特征(圖1a)。在應(yīng)用時(shí)，DEBRIS采取滑動(dòng)窗口逐幀預(yù)測(cè)局部特征，這一過(guò)程將強(qiáng)度-時(shí)間軌跡轉(zhuǎn)換為模式-時(shí)間軌跡(圖1b)。隨后，根據(jù)用戶定義的標(biāo)準(zhǔn)將其進(jìn)一步分類為不同組別，并識(shí)別單分子事件。結(jié)合預(yù)測(cè)短片段的局部特征、滑動(dòng)窗口技術(shù)和用戶定義的標(biāo)準(zhǔn)，DEBRIS能夠適應(yīng)任意模式和任意長(zhǎng)度的雙通道熒光軌跡，為單分子熒光事件的自動(dòng)識(shí)別提供了一種強(qiáng)大的工具。
圖1.DEBRIS的訓(xùn)練集構(gòu)建和基本流程
為了評(píng)估DEBRIS在雙色熒光軌跡上的分類性能，研究人員使用了五組單分子雙色FRET數(shù)據(jù)集(圖2)。以人工分類結(jié)果作為基準(zhǔn)時(shí)，DEBRIS獲得的FRET分布與人工分類結(jié)果相似性達(dá)到99%。這一結(jié)果凸顯了DEBRIS的準(zhǔn)確性，同時(shí)顯示出DEBRIS在效率、客觀性和可重復(fù)性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。
圖2.DEBRIS分類性能評(píng)估
研究人員利用DEBRIS首次實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)態(tài)出現(xiàn)的熒光信號(hào)的準(zhǔn)確識(shí)別。動(dòng)態(tài)單分子熒光信號(hào)是指在采集開始時(shí)并不存在熒光信號(hào)，但由于擴(kuò)散的標(biāo)記分子與表面固定的分子相互作用導(dǎo)致熒光信號(hào)在采集過(guò)程中出現(xiàn)(圖3)。例如，在研究Cas12a對(duì)DNA的切割過(guò)程中，可以動(dòng)態(tài)捕捉到Cas12a結(jié)合、切割和DNA片段解離等一系列動(dòng)態(tài)過(guò)程(圖3a)。但已發(fā)表的深度學(xué)習(xí)模型尚無(wú)法有效處理此類動(dòng)態(tài)單分子熒光信號(hào)。研究人員展示了DEBRIS可自動(dòng)識(shí)別出Cas12a的結(jié)合和切割事件，并基于分類結(jié)果生成了FRET概率隨時(shí)間變化密度圖，可表征切割過(guò)程中Cas12a的一系列復(fù)雜構(gòu)象變化。
圖3.DEBRIS在捕捉動(dòng)態(tài)熒光信號(hào)中的應(yīng)用
DEBRIS模型雖然是利用雙色跡線進(jìn)行訓(xùn)練的，但也可以拓展用于單色單分子熒光軌跡。研究人員對(duì)此也進(jìn)行了驗(yàn)證(圖4)
圖4.DEBRIS在單色單分子熒光軌跡上的應(yīng)用
DEBRIS通過(guò)精準(zhǔn)識(shí)別單分子熒光軌跡的局部特征，并允許根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活調(diào)整分類標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)了在不修改神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的前提下，對(duì)雙色/單色實(shí)驗(yàn)條件下的穩(wěn)定和動(dòng)態(tài)單分子熒光信號(hào)進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別。這種創(chuàng)新的方法為單分子熒光技術(shù)的應(yīng)用提供了一個(gè)高效的數(shù)據(jù)分析工具，極大地?cái)U(kuò)展了其在生物物理研究中的潛力。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳春來(lái)副教授為論文通訊作者，生命科學(xué)學(xué)院2021級(jí)博士生周書棋為論文第一作者。生命科學(xué)學(xué)院2024屆博士畢業(yè)生苗昱、2023級(jí)博士生邱浩仁和香港科技大學(xué)數(shù)學(xué)系教授姚遠(yuǎn)為研究提供了重要支持。研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)與香港研究資助局聯(lián)合科研資助基金、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的支持。
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