反硝化細菌的篩選及培養方法！

                反硝化細菌的篩選及培養方法！

反硝化細菌的篩選及培養方法！

反硝化細菌是一種能引起反硝化作用的細菌。多為異養、兼性厭氧細菌，如反硝化桿菌、斯氏桿菌、螢氣極毛桿菌等。反硝化細菌 ( denitrifying  bacteria )通過誘導產生硝酸還原酶和亞硝酸還原酶對硝酸鹽和亞硝酸鹽進行還原。不同反硝化細菌的反硝化作用能力不同，生長條件也存在很大差異。作者從玉溪紅塔集團技術中心生理生化實驗室篩選出的45株具有反硝化作用的細菌菌株中， 進一步篩選具有較強反硝化作用能力的菌株，并對目的菌株的適培養基、生長溫度及好氣性進行測定 ，為反硝化細菌的利用提供依據。至于該菌的篩選及培養條件如下：

一、材料

菌株及來源

反硝化細菌菌株： B11，B15，B20，B27，B28，B67，B88，B112，B115，B118，B121，B132，B135，B223，B224，B226，B237，B241，B246，B248，B249，B260，B289，B290，B291，B292，B294，B295，B296，B297，B298，B299，B300，B310，B311，B315，B316，B318，B319，B320，B322，B323，B329，B330，B419。

培養基及制備

1.Giltay培養基

A溶液：KNO3 1.0g ，天冬酰胺1.0g ，1％BTB酒精溶液5mL ，蒸餾水500mL 。

B溶液：檸檬酸鈉8.5g ，MgSO4· 7 H 2O 1.0g ，F e Cl3·6 H 2 O 0.05g ，KH 2 PO4  1.0g ，CaC12· 2.H 2O 0.2g ，蒸餾水500mL 。

混合A、 B兩溶液調節pH值為7.0～7.2，分別裝入250mL三角瓶，每瓶150mL，滅菌備用。

2.待篩培養基

硝酸鹽培養基：牛肉浸膏3g ，蛋白胨5g ，KNO3 ( NaNO3 ) 1g，蒸餾水1000mL。

反硝化細菌培養基：KNO32g ， MgSO4·7 H2O 0.2g ，K2HPO4  0.5g ，酒石酸鉀鈉20g ，蒸餾水1000mL 。

3.Y B培養基。

調節待篩培養基和YB培養基pH為7.2，分別裝入250mL三角瓶，每瓶150mL，滅菌備用。

4.斜面培養基

牛肉浸膏蛋白胨培養基。

儀器與器材

自動化學分析儀，CO2培養箱，血球計數板，搖床。

二、方法

菌株反硝化作用能力的測定

1.產氣特性測定

參考Giltay方法測定反硝化作用菌株的產氣特性：

將制備的Giltay液體培養基，加入大試管( 20mm×200mm)中，把纏有細線的小試管 ( 12mm×75mm ) 倒立放入大試管中，將小試管中的氣體排凈，塞住大試管，留部分細線在大試管外，便于小試管的提升和降落，滅菌備用。

用 Giltay液體培養基2mL洗下活化后的菌株， 轉入盛有小試管和Giltay液體培養基的大試管中，將小試管提升一段距離，以便接收氣體，接種時注意不要使小試管內進入氣體。每個菌株接4支試管，30℃恒溫培養10～14d，觀察結果。重復3次。

2.硝酸鹽降解能力的測定

將產氣試管內的培養基濾紙過濾，取濾液，用蒸餾水稀釋100倍 ，以自動化學分析儀檢測培養基中的含氮量，測定菌株的反硝化作用能力，重復3次。以滅菌后的培養基作為對照。

3.菌株適宜培養基及好氣性測定

將篩選出的菌株在斜面上30℃培養1d后，用10mL無菌水洗下，振蕩混勻。分別轉接1mL洗下的菌液于滅菌的硝酸鹽培養基、反硝化細菌選培養基和YB培養基中。每個處理都分別在搖床和CO2培養箱( CO2濃度為20％) 中，30℃振蕩培養1d。稀釋平板法測定篩選菌株的適培養基及好氣性。重復3次。

4.生長溫度的測定

設20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等5種溫度梯度，30℃YB培養基培養1d ，稀釋平板法測定菌株生長的適溫度。

5.菌體濃度的測定

設18、21、24、27、30、33 h等7個時間梯度，30℃YB培養基培養，用血球計數法測定所篩菌株在適生長條件下菌體的濃度。

三、結果與分析

菌株反硝化作用強度的篩選

1.產氣測定

在接種B88、B237菌株的試管內，2d后培養基開始變藍，并有少量氣體產生，滯留在小試管中；3d后培養基由綠色變為藍色，小試管內的氣體明顯增多；接種3～4d后，產氣的速度，氣體量多，以后幾天則看不出氣體量的增加。接種其他菌株的試管內，培養基顏色由上向下逐漸變藍 ，但不產氣。

利用Giltay培養基法篩選菌株，試管中的培養基由于反硝化細菌硝酸還原酶的作用，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，使培養基呈堿性，培養基顏色由綠色變為藍色。反硝化作用較強的菌株通過亞硝酸還原酶的作用，亞硝酸鹽進一步還原成*或氮氣， 滯留在小試管中。在45個供試菌株中，B88和B237菌株能夠較好地降解培養基中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，產氣早，速度快，3～4d產氣達到高峰，表明其反硝化作用較強。其他菌株雖然也都能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，但不能進一步還原亞硝酸鹽，反硝化作用較弱。

2.菌株降解硝酸鹽特性的測定

在接種B88 、B237的培養基中，含氮量明顯降低，表明B88 、 B237菌株具有較強的反硝化作用，能夠有效降解培養基中的硝酸鹽。

3.生長溫度測定

溫度對B88、B237菌株的生長速度有顯著影響，在好氣條件下，用YB培養基振蕩培養，菌株在20℃～40℃之間均能較好地生長，30℃左右為適生長溫度。

4.生長濃度的測定

反硝化細菌經過緩慢增*和指數增*后，由于營養的消耗和細菌之間的抑制作用， 菌體衰老、 消解，細菌濃度逐漸降低。B88菌株在適培養條件下生長濃度為6.1×10個·mL-1，B237菌株在適培養條件下生長濃度為1.54×10^8個· mL-1。

5.培養基及好氣性測

由于反硝化細菌是在厭氧或微厭氧的條件下通過硝酸鹽誘導產生的硝酸還原酶和亞硝酸還原酶進行反硝化作用，因此，大多數研究人員在實驗室培養反硝化細菌時，多在微厭氧條件下進行。但本試驗結果表明，不管有無硝酸鹽的誘導，B88、B237菌株的快速生長是好氣性的，生長受氧氣供應量的限制，CO2含量(20％)的提高，對菌株的生長具有較強抑制作用； 在不同培養基上，其生長速度差別較大；在反硝化細菌培養基上生長速度反而慢 ， 而在YB培養基中的 生長速度快。

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