?樣品要求及注意事項(xiàng)：
1、 如果提供實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)材料必須保證新鮮，請(qǐng)您采樣后立刻放入液氮中速凍或加入樣穩(wěn)定劑，并用干冰運(yùn)輸。
2、 如果樣品可以用Trigol法提總RNA ，也可以將樣品研磨后放在 Trigol中，動(dòng)植物組織 ： 50～100mg/mlTrigol，貼壁細(xì)胞：10cm2/mlTrigol，懸浮細(xì)胞：5×106動(dòng)植物，酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞10×107/mlTrigol。
3、 如果提供RNA或cDNA我們要對(duì)您提供的材料進(jìn)行評(píng)估。
4、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR服務(wù)您一定要提供樣品及要擴(kuò)增基因的詳細(xì)信息。
斯氏普羅威登斯菌探針法熒光定量PCR試劑盒運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。使用本試劑盒提供的陽性對(duì)照時(shí)，由于其濃度較高，一定要注意不要污染其他試劑和成分。在專門的區(qū)域操作。
產(chǎn)品名稱 | 斯氏普羅威登斯菌探針法熒光定量PCR試劑盒 |
英文名稱 | Providencia stuarti |
貨號(hào) | CP914754 |
儲(chǔ)存條件：
14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，產(chǎn)品僅用于科研請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
相對(duì)定量簡介：
分析方法： ①雙標(biāo)曲法 ②2 － △Ct ③2 － △△Ct ④Pfaffi法
①雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法簡介
公式：
優(yōu)點(diǎn)：分析簡單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化簡單
缺點(diǎn)：對(duì)每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線；必需有固定的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線；這些標(biāo)準(zhǔn)品并不代表樣品擴(kuò)增的真實(shí)狀態(tài)應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中與*的兩種相對(duì)定量方法之一
實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保溫7min。
3：結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
熒光定量PCR檢測(cè)方法包括以下步驟：
(1)產(chǎn)品僅用于科研將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2)待測(cè)樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果。
其中步驟(1)為：將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
其中所述參照基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴(kuò)增區(qū)域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標(biāo)準(zhǔn)品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標(biāo)準(zhǔn)品中待測(cè)目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題，提高HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)的可靠性。
步驟(2)為：待測(cè)樣本與步(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果。
其中所述待測(cè)目的基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)待測(cè)目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴(kuò)增區(qū)域，所述熒光定量PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴(kuò)增方法，所述熒光定量PCR擴(kuò)增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴(kuò)增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴(kuò)增。
乳脫氫酶染色液(M型， 規(guī)格四唑鹽法)， 規(guī)格2*50ml 進(jìn)口/原裝
過氧化物酶染色液(聯(lián)法)， 規(guī)格3*10ml 進(jìn)口/原裝
過氧化物酶染色液(聯(lián)法)， 規(guī)格3*20ml 進(jìn)口/原裝
過氧化物酶染色液(氧化WG-KI法)， 規(guī)格2*10ml 進(jìn)口/原裝
過氧化物酶染色液(氧化WG-KI法)， 規(guī)格2*20ml 進(jìn)口/原裝
一氧化氮合酶染色液， 規(guī)格2*10ml 進(jìn)口/原裝
一氧化氮合酶染色液， 規(guī)格2*20ml 進(jìn)口/原裝
糖原PAS染色液， 規(guī)格4*100ml 進(jìn)口/原裝
糖原PAS染色液， 規(guī)格4*50ml 進(jìn)口/原裝
糖原PAS染色液(細(xì)胞)， 規(guī)格4*20ml 進(jìn)口/原裝
糖原PAS染色液(細(xì)胞)， 規(guī)格4*50ml 進(jìn)口/原裝
AB-PAS染色液， 規(guī)格6*100ml 進(jìn)口/原裝
AB-PAS染色液， 規(guī)格6*50ml 進(jìn)口/原裝
糖原PAS快速染色液， 規(guī)格3*100ml 進(jìn)口/原裝
糖原D-PAS染色液(淀粉酶消化法)， 規(guī)格5*100ml 進(jìn)口/原裝
組蛋白H3-K9（mono/di/tri）甲基化檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：10/20次等
組蛋白H3-K18（mono）甲基化檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：10/20次等
組蛋白H3-K23甲基化（mono/di）檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：10/20次等
組蛋白H3-K27（mono/di/tri）甲基化檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：10/20次等
組蛋白H3-K36（mono/di/tri）甲基化檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：10/20次等
組蛋白H3-K56（mono/di）甲基化檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：10/20次等
組蛋白H3-K79（mono/di/tri）甲基化檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：10/20次等
組蛋白H3-K122（mono）甲基化檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：10/20次等
組蛋白H4-K20（mono/di/tri）甲基化檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：10/20次等
組蛋白H4-K31（mono）甲基化檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：10/20次等
斯氏普羅威登斯菌探針法熒光定量PCR試劑盒Escherichiacoli資源名稱大腸埃希氏菌提供形式:凍干物人PDI ELISA試劑盒
Schwariomyces│occidentalis資源名稱許旺酵母變種提供形式:凍干物人CAD ELISA試劑盒
Kluyveromyces marxianus資源名稱馬克斯克魯維酵母分離基物:酸牛奶人γ-ECS ELISA試劑盒
Citeromyces│matritensis資源名稱固囊酵母分離基物:大麥曲人E1/UBAE ELISA試劑盒
Endomyces│fibuligera資源名稱扣囊內(nèi)孢霉提供形式:凍干物人PP ELISA試劑盒
Zygosaccharomyces│rouxii資源名稱魯氏結(jié)合酵母提供形式:凍干物人HK ELISA試劑盒
Trichosporon capitatum Diddens et Lodder資源名稱頭狀絲孢酵母提供形式:凍干粉人PDH E1 ELISA試劑盒
