大鼠視網(wǎng)膜muller細(xì)胞永生化細(xì)胞操作注意事項(xiàng)

在操作大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞永生化細(xì)胞系時(shí)，需特別注意培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌性。實(shí)驗(yàn)前需用75%酒精擦拭超凈工作臺(tái)，紫外線照射30分鐘以上，并提前預(yù)熱培養(yǎng)基至37℃。傳代時(shí)建議使用低濃度（0.05%-0.1%）進(jìn)行短時(shí)消化，密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化，當(dāng)細(xì)胞邊緣開(kāi)始回縮時(shí)立即加入含血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

對(duì)于凍存與復(fù)蘇環(huán)節(jié)，推薦采用程序性降溫盒進(jìn)行梯度凍存，凍存液中應(yīng)包含10%DMSO和20%胎牛血清。復(fù)蘇時(shí)需快速解凍，37℃水浴中輕柔搖晃至冰晶消失后，立即轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的培養(yǎng)基中離心去除凍存液。換液應(yīng)在培養(yǎng)4-6小時(shí)后進(jìn)行，避免頻繁移動(dòng)培養(yǎng)瓶影響細(xì)胞貼壁。

在誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，需特別注意血清濃度的梯度調(diào)整。建議從10%FBS的培養(yǎng)基逐步過(guò)渡到1%或無(wú)血清培養(yǎng)基，過(guò)程中每日觀察細(xì)胞形態(tài)變化。若出現(xiàn)異常空泡化或突觸回縮，應(yīng)立即暫停實(shí)驗(yàn)并檢測(cè)培養(yǎng)基滲透壓（正常范圍280-320 mOsm/kg）。

基因轉(zhuǎn)染操作推薦使用脂質(zhì)體法，質(zhì)粒濃度控制在1-2μg/μl，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)需更換新鮮培養(yǎng)基以降低毒性。熒光標(biāo)記后需設(shè)置未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，避免自發(fā)熒光干擾結(jié)果判讀。所有操作均需在生物安全柜中進(jìn)行，廢液須經(jīng)0.1%次氯酸鈉處理后再棄置。

定期進(jìn)行支原體檢測(cè)（建議每月一次），若發(fā)現(xiàn)污染應(yīng)立即隔離該批次細(xì)胞，并使用含5%CO?的加濕培養(yǎng)箱維持pH穩(wěn)定性。長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)需注意代次限制，建議在25代以內(nèi)完成關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)，避免出現(xiàn)基因組不穩(wěn)定性。