實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保溫7min。
3：結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4：PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
參數(shù)規(guī)格：
產(chǎn)品名稱：轉(zhuǎn)基因構(gòu)建FMV啟動(dòng)子-PVY基因PCR試劑盒
貨號(hào):CP97485
產(chǎn)品規(guī)格：50T
產(chǎn)品運(yùn)輸：低溫運(yùn)輸
產(chǎn)品保存：-20℃保存
產(chǎn)品有效期：一年
運(yùn)輸：低溫
注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。
PCR檢測(cè)方法包括以下步驟：
(1)將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2)待測(cè)樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果。
其中步驟(1)為：將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
其中所述參照基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴(kuò)增區(qū)域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標(biāo)準(zhǔn)品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標(biāo)準(zhǔn)品中待測(cè)目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題，提高HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)的可靠性。
步驟(2)為：待測(cè)樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果。
其中所述待測(cè)目的基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)待測(cè)目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴(kuò)增區(qū)域，所述熒光定量PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴(kuò)增方法，所述熒光定量PCR擴(kuò)增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴(kuò)增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴(kuò)增。
使用方法:
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，*用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 陽(yáng)性對(duì)照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽(yáng)性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于PCR 陽(yáng)性對(duì)照。
以下是轉(zhuǎn)基因構(gòu)建FMV啟動(dòng)子-PVY基因PCR試劑盒公司正在熱銷的產(chǎn)品：
青霉素/鏈霉素/新霉素
PENICILLIN/STREPTOMYCIN/NEOMYCIN分子式：分子量：
鹽酸萬(wàn)古霉素 1404-93-9
Vancomycin HCL分子式：C66H76CL3N9O24分子量：1485.67
萬(wàn)古霉素A02
鹽酸萬(wàn)古霉素 1404-93-9
Vancomycin HCL分子式：C66H76CL3N9O24分子量：1485.67
萬(wàn)古霉素A02
鹽酸萬(wàn)古霉素 1404-93-9
Vancomycin HCL分子式：C66H76CL3N9O24分子量：1485.67
萬(wàn)古霉素A02
2 ugpEBFP-MitopEBFP-Mito低溫運(yùn)輸，-20℃保存
2 ugpEBFP-N1pEBFP-N1低溫運(yùn)輸，-20℃保存
2 ugpEBFP-C1pEBFP-C1低溫運(yùn)輸，-20℃保存
2 ugpECFP- N1pECFP- N1低溫運(yùn)輸，-20℃保存
2 ugpECFP-MEMpECFP-MEM低溫運(yùn)輸，-20℃保存
2 ugpECFP-MitopECFP-Mito低溫運(yùn)輸，-20℃保存
2 ugpECFP-NucpECFP-Nuc低溫運(yùn)輸，-20℃保存
2 ugpECFP-PeroxipECFP-Peroxi低溫運(yùn)輸，-20℃保存
2 ugpEcoli-6xHN-GFPuvpEcoli-6xHN-GFPuv低溫運(yùn)輸，-20℃保存
轉(zhuǎn)基因構(gòu)建FMV啟動(dòng)子-PVY基因PCR試劑盒S100鈣結(jié)合蛋白A8(S100A8)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法) 規(guī)格： 48T/96T
S100鈣結(jié)合蛋白A8(S100A8)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法) 規(guī)格： 48T/96T
S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100A9)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法) 規(guī)格： 48T/96T
S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100A9)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法) 規(guī)格： 48T/96T
S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100A9)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法) 規(guī)格： 48T/96T
S100鈣結(jié)合蛋白B(S100B)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法) 規(guī)格： 48T/96T
肌球蛋白重鏈7B(MYH7B)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法) 規(guī)格： 48T/96T
肌球蛋白重鏈8(MYH8)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法) 規(guī)格： 48T/96T
肌球蛋白重鏈8(MYH8)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法) 規(guī)格： 48T/96T
肌球蛋白重鏈9(MYH9)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法) 規(guī)格： 48T/96T
肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(DMD)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法) 規(guī)格： 48T/96T
肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(DMD)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法) 規(guī)格： 48T/96T
