ELISA試劑盒過碘酸鈉氧化法

本法是目前ELISA試劑盒酶標(biāo)記抗體較好的方法，能使70%酶與90%以上球蛋白結(jié)合。采用本法首先是用氟代二硝基苯（Fluoro dinitro bengene 2.4—硝基苯，F(xiàn)DNB）封閉HRP表面的游離氨基（亦可用甲醛或戊二醛來封閉），從而提高酶結(jié)合抗體球蛋白的能力，避免酶的自身交聯(lián)。然后用過碘酸鈉來氧化HRP表面結(jié)構(gòu)的醣鏈部份（即低聚醣基團(tuán)）使成醛基，使其直接與抗體球蛋白上的游離氨基形成共價(jià)鍵而結(jié)合。zui后用硼氫酸鈉還原，使HRP表面醛基能充分與抗體球蛋白上氨基進(jìn)行反應(yīng)，使之形成穩(wěn)定的結(jié)合物。其反應(yīng)式如下:
               NH2                         N=CH2
（1）     Fe—E            +HCHO---->  Fe—E            +H2O
               CH2OH                       CH2OH
            N=CH2        NaIO4         N=CH2
   （2）   Fe—E             +O---->Fe— E               + H2O
                   CH2OH                     CHO
                 N=CH2                                                N= CH2  
（3） Fe—E           +H2N-Ig--->  Fe—E               + H2O
              CHO                          C=N-Ig
                                           H
ELISA試劑盒標(biāo)記步驟是：10mg HRP溶于新鮮配制的0.3 mol/L PH 8.1*2ml中，加0.2ml1%氟代二硝基苯無水乙醇溶液，室溫中攪拌1小時(shí)以封閉HRP表面的游離氨基。再加2ml 0.08 mol/L NaIO4水溶液，于室溫中輕攪30分鐘，用0.16 mol/L乙二醇溶液終止氧化反應(yīng)。1小時(shí)后移入透析袋中置0.01 mol/L PH 9.5的碳酸鹽緩沖液中透析過夜，除去試劑，透析袋中的即為醛化酶。
取6ml醛化酶加20mg抗體球蛋白（用2ml碳酸鹽緩沖液溶解），混勻，室溫?cái)嚢?-3小時(shí)后加10mg硼氫酸鈉鹽，4℃冰箱4小時(shí)或過夜。次日取出加等量飽和硫酸銨沉淀酶結(jié)合物（去游離酶），并用50%飽和硫酸銨洗滌1-2次。再溶于3ml PH 7.4 PBS中，并置透析袋經(jīng)透析除鹽，如有沉淀藉離心除去。上清酶結(jié)合物加入等量60%甘油PBS，分裝保存，冰箱備用。
如采用改良過碘酸鈉簡(jiǎn)化法制備酶結(jié)合物，比原法更簡(jiǎn)便、快速，所獲制品質(zhì)量良好。其方法是取10mg HRP加1ml0.1 mol/L醋酸鈉或水溶解，充分混勻，約5分鐘后加0.08 mol/L NaIO4，水溶液1.0ml混合后，置冰箱內(nèi)20分鐘，加0.4 mol/L乙二醇溶液0.5ml終止氧化反應(yīng)，30分鐘后加21% NaCL溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的無水乙醇（AR）沉淀醛化酶，離心去上清，沉淀酶再用6ml 80%冰冷的乙醇溶液浸泡洗滌一次后，離心傾去乙醇（盡量去除乙醇），沉淀用PH9.6的0.05 mol/L碳酸鈉緩沖液2ml溶解，然后加入2ml羊或馬抗人IgG（內(nèi)含蛋白量20mg左右），攪拌均勻，置冰箱內(nèi)過夜，次日取出加10mg NaBH4 混勻，3小時(shí)后加等量飽和硫酸銨沉淀酶結(jié)合物，離心，去上清，沉淀用50%飽和硫酸銨洗滌一次，離心，再去上清，沉淀用0.01 mol/L PBS 3ml溶解，置透析袋中用冰冷的生理鹽水透析除鹽（需換液5次），如有沉淀藉離心除去，上清呈淡棕色即為酶結(jié)合物。加60%甘油PBS，分裝保存?zhèn)溆谩?br />制備好的酶結(jié)合物，要作兩者克分子比和使用稀釋度的測(cè)定，標(biāo)記率的測(cè)定（A403/A280—0.4—1.0為宜）。
1、酶結(jié)合物克分子比測(cè)定：將制備好的酶結(jié)合物經(jīng)適當(dāng)稀釋在分光光度計(jì)中以280nm和403nm測(cè)O.D值，然后按下列公式計(jì)算兩者的克分子比。
（1）酶戊二醛交聯(lián)法的計(jì)算：
酶量：mg/ml=O.D403nm×0.4,其中0.4為酶O.D403nm=1.0時(shí)相當(dāng)于0.4mg酶。
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.42）×0.94×0.62
其中O.D403nm×0.42為酶蛋白結(jié)合戊二醛后在280nm應(yīng)有的O.D，抗體球蛋白0.62為蛋白質(zhì)與酶--戊二醛結(jié)合后O.D280nm值約應(yīng)以加6%，故以0.94校正之。換算系數(shù)，故zui后要乘于0.62。
（2）ELISA試劑盒用過碘酸納氧化法的計(jì)算：
酶量：mg/ml同上：
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.3）×0.62
其中O.D403nm×0.3為酶蛋白本身在280nm應(yīng)有的O.D值。
已知酶量和球蛋白量，即可求出酶結(jié)合物的克分子比。