PCR實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范

PCR實(shí)驗(yàn)，全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)通過模擬DNA天然復(fù)制過程，利用引物、DNA聚合酶和脫氧核苷酸（dNTP）實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。其核心原理基于DNA雙鏈的變性、引物的退火結(jié)合以及DNA聚合酶的延伸合成三個(gè)步驟的循環(huán)重復(fù)。

1、前期準(zhǔn)備：

l 模板DNA提取與純化：從細(xì)胞、血液或組織中提取DNA/RNA，去除蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)。DNA建議用TE緩沖液保存于-20℃，RNA需置于-80℃。

l 引物設(shè)計(jì)：根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)特異性引物，確保退火溫度匹配。

2、反應(yīng)體系配置：

l 包含模板DNA、引物、Mg2?、DNA聚合酶及緩沖液。

l 熱啟動(dòng)PCR需額外添加修飾物（如抗體）抑制酶活性。

3、循環(huán)程序：

l 初始變性（94-98℃，5分鐘）→ 循環(huán)變性（93-98℃，30秒）→ 退火（50-65℃，30秒）→ 延伸（72℃，1分鐘）→ 重復(fù)25-35次 → 最終延伸（72℃，5分鐘）。

4、產(chǎn)物分析：

l 普通PCR：瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶大小。

l qPCR：通過熒光信號(hào)積累曲線定量分析。

l 膠回收：若存在非特異擴(kuò)增，需跑膠后回收目的片段純化。

PCR成功率取決于細(xì)節(jié)控制。PCR技術(shù)作為分子生物學(xué)基石，持續(xù)推動(dòng)生命科學(xué)邊界拓展。其核心價(jià)值在于將不可見的DNA片段轉(zhuǎn)化為可量化、可分析的宏觀產(chǎn)物，為人類理解生命本質(zhì)和應(yīng)對(duì)健康挑戰(zhàn)提供關(guān)鍵工具。