Argolight熒光顯微成像校準工具

Argolight是一家法國的公司，專注于成像質量的控制，公司最初是為了解決NASA提出的請求，幫助他們保障國際空間站上的顯微鏡的準確性和可靠性，以達到驗證顯微鏡質量且可以重復實驗結果的目的。經過幾年的努力，多代產品的更新，最終得到了NASA的認可，也親眼見證了Argolight的產品搭乘著SpaceX的火箭，同宇航員一同進入了國際空間站。

現在已經有300多個客戶在使用我們的產品，我們正在與他們一起應對成像質量和可重復性問題。

Argolight的產品滿足ISO 21073:2019 標準，該標準旨在用于評估共焦激光掃描顯微鏡圖像性能的指標，用于熒光生物標本成像領域。并且積極與NIST合作，旨在為成像質量評估出一個標準。

我們的產品包含穩(wěn)定的熒光圖案，具有精確定義的特征。圖案可以用250nm到650nm之間的任何波長激發(fā)。發(fā)射光譜是一個寬的連續(xù)譜，從略高于激發(fā)波長開始，一直到800 nm。

一個產品包含幾個熒光圖案。每個圖案都旨在評估顯微鏡的一個或多個參數：分辨率、場均勻性、強度響應、通道之間的配準精度等。Argolight的熒光圖案是一種無機熒光物質，可以重復使用長達數年之久，并且對于貯存條件沒有要求。Daybook軟件也供免費使用，即便您不購買Argolight的軟件，Daybook依然可以幫助您進行PSF的測量。

在今年Argolight使用一種改進的玻璃技術，產生兩倍的熒光量：AG03，第三代 ArgoGlass®。AG03經過3年的研發(fā)，相比AG02具有更高的量子效率。在相同曝光下，這些圖案現在比代顯示出至少 99% 的熒光強度。校準片內熒光的存在仍然是確定的且持久的，熒光圖案將永遠可見。就此而言，這些校準片現在終身保修。

接下來我們展示一個具體的Confocal.nl的案例，該案例使用 Argo-SIM 來展示其橫向分辨率的優(yōu)勢。

使用 RCM1 技術以 60x 1.4 放大倍率獲取的示例圖像（2×2 拼接圖像）。COS-7 細胞中的微管蛋白絲。 Andreas Kurz，德國維爾茨堡大學

Confocal.nl是一家荷蘭制造商，它開發(fā)了一種技術用來提高橫向分辨率，同時保持標準共聚焦顯微鏡的切片能力。該公司由Erik Manders和Peter Drent于 2016 年創(chuàng)立。第二代再掃描共聚焦顯微鏡（RCM）是2021 年推出的一種新的超分辨率顯微成像技術，它基于標準共焦顯微鏡，擴展了一個光學單元（再掃描），可將圖像直接投射到 CCD 相機上。為了展示新系統(tǒng)的分辨率，制造商需要用已知尺寸的樣品，通常使用熒光微球。然而，Confocal.NL 決定不再使用熒光微球，因為它們“有時難以集中拍攝并隨著時間的推移而漂白”。此外，由于它們的尺寸不是無限小，導致擴大了顯微鏡點擴散函數 (PSF)，因此低估了光學系統(tǒng)的分辨率。

Confocal.nl 使用 Argo-SIM 的熒光模式進行分辨率測量。 該圖案呈現出成對的 36 μm 長線，其間距逐漸增加，從 0 到 390 nm，步長為 30 nm。存在四組線：一組垂直，一組水平，兩組位于 + 和 - 45°

Confocal 最終決定使用 Argolight 校準片而不是熒光微球或PSF方式。某些型號的 Argolight校準片里面的熒光圖案，專用于測量分辨率。該圖案的線條由已知的距離隔開，這使得它非常適合測量系統(tǒng)區(qū)分物體的能力。Argolight 提供免費的圖像分析軟件Daybook。Daybook 中使用的方法依賴于對比度傳遞函數，即測量對比度與逐漸間隔的線之間的距離。

Confocal.nl使用帶有 100x/1.5 油物鏡 (UPLAPO100XOHR) 的 Olympus IX83 顯微鏡框架，使用其RCM2對Argo-SIM 校準片的熒光圖案進行成像。在Argo-SIM 中，圖案由成對的36 μm 長的線組成，它們的間距逐漸增加，從0到390 nm，步長為30 nm。該圖案由405nm 激光激發(fā)，用Tucsen FL20-BW 相機檢測。在應用說明：“使用 Argolight Argo-SIM校準片測量的再掃描共聚焦顯微鏡的橫向分辨率”中，Confocal.nl指出：

采集設置樣本平面中的像素大小為 16.5nm/像素，顯微鏡的 z-stepper 設置為 100nm 間隔，總共采用 4μm的 z-stack 以便能夠進行適當的反卷積。隨后由具有專用 RCM 點擴散函數的 Microvolution 執(zhí)行反卷積。這些圖顯示了具有理想焦點的 z 軸切片。隨后使用來自 Argolight 的 Daybook 3 軟件對數據集進行分析，使用高斯擬合模型和 7.3% 的對比度標準獲得結果（對應于在理想成像條件下等于顯微鏡 PSF 的 FWHM 的對比度值）。

用肉眼看圖案圖像，在150nm的距離就可以分辨出分辨率。對圖像應用去卷積，之后圖案的線條可以在120nm處解析。Daybook 中的圖像分析使用 7.3% 的對比度標準（高斯擬合），在反卷積之前提供了 178.5nm 的橫向分辨率，之后提供了 120nm 的橫向分辨率。

“ Argo-SIM 校準片使我們能夠定量和準確地確定 RCM2 的橫向分辨率水平，而不會引入用戶偏見。” Confocal.nl

Daybook 中橫向分辨率分析的示例結果（Zeiss 寬場 Axio Imager M2，配備 Zeiss Plan-Apochromat 63×/1.4 Oil 物鏡，使用 Zeiss Colibri 2 照明，使用 Hamamatsu Orca-Flash 4.0 LT 相機收集） 7.3% 對比度標準（高斯擬合），分辨率為 386nm。

使用 Argo-SIM 校準片及其熒光圖案，Confocal.nl 可以準確地確認他們的新系統(tǒng) RCM2 達到了先前指定的規(guī)格并在圖像中實現了超分辨率。這種方法提供的結果可以使其他研究人員或客戶信任，因為他們的協(xié)議記錄在案并依賴于 Argolight 的高質量認證標準。Argolight 非常自豪能夠為 Confocal.NL 提供工具來展示他們的創(chuàng)新技術。

Argolight擁有數種產品，以滿足不同客戶的需求：

如果您對成像質量有要求，或者對自己的成像系統(tǒng)有所懷疑，不要猶豫，立即聯(lián)系我們產品經理。