離子交換色譜原理

       離子交換色譜法

　　純化蛋白質和其他帶電分子的方法是離子交換色譜法。在陽離子交換色譜中，帶正電荷的分子被帶負電荷的固體支持物所吸引。相反，在陰離子交換色譜中，帶負電的分子被帶正電的固體支持物吸引。


　　機制

　　為了優化所有帶電分子的組合，流動相通常是具有低至中等電導率(即低至中等鹽濃度)的溶液。分子在固體載體上的吸附是由樣品分子中帶相反電荷的離子基團和載體上的功能配體之間的離子相互作用驅動的。相互作用的強度取決于分子和官能團上電荷的數量和位置。通過增加鹽濃度(通常通過使用線性鹽梯度)，具有最弱離子相互作用的分子首先開始從色譜柱中洗脫。具有更強離子相互作用的分子需要更高的鹽濃度，并在梯度中更晚洗脫。離子交換樹脂的結合能力通常很高。


　　緩沖液pH值

　　通常，流動相緩沖液的pH值必須在帶電分子的pI(等電點)或pKa(酸離解常數)和固體載體上帶電基團的pKa之間。例如，在陽離子交換色譜中，使用pKa為1.2的固體載體上的官能團，pI為8.2的樣品分子可以在pH為6.0的流動相緩沖液中運行。在陰離子交換層析中，當固相支持物的pKa為10.3時，pI為6.8的分子可以在pH為8.0的流動相緩沖液中運行。


　　鹽梯度

　　與大多數其他色譜模式(SEC除外)一樣，蛋白質樣品在強保留條件下被注入色譜柱。然后應用線性增加的鹽濃度梯度從柱中洗脫樣品成分。另一種使用線性漸變的方法是使用梯形漸變。這需要不太復雜的設備。如果適當的鹽濃度是已知的(通常來自線性梯度實驗)，不同的級分可以被非常有效地洗脫。


　　不同的pH值

　　許多色譜工作者也利用pH值的變化來影響分離。在陽離子交換色譜中，提高流動相緩沖液的pH值會降低分子的質子化程度，因此正電荷的程度也會降低。結果，蛋白質不再能與帶負電荷的固體支持物形成離子相互作用，最終導致分子從柱上洗脫。在陰離子交換色譜中，降低流動相緩沖液的pH值會使分子變得更加質子化，從而攜帶更多的正電荷(和更少的負電荷)。結果，蛋白質不再能與帶正電荷的固體支持物形成離子相互作用，這導致分子從柱中洗脫。