離子交換色譜是如何工作的？

     

　　生物分子具有能在溶液中電離并賦予分子特定凈電荷的官能團(tuán)。例如，蛋白質(zhì)由帶有氨基(-NH  2)和羧酸(-COOH)的官能團(tuán)組成。蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)決定了哪些氨基酸殘基暴露在其表面。根據(jù)介質(zhì)的pH值，這些殘基被電離，使得分子表面帶有正負(fù)電荷。在低pH值下，更多的氨基被質(zhì)子化，蛋白質(zhì)分子帶有凈正電荷。另一方面，在較高的pH值下，更多的羧酸基團(tuán)被去質(zhì)子化，產(chǎn)生的陰離子使蛋白質(zhì)分子表面帶負(fù)電荷。表面上離子化官能團(tuán)的總數(shù)決定了表面凈電荷，每個(gè)分子在任何給定的pH值下都有的表面凈電荷。蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)(pI)是電中性的，等電點(diǎn)是一個(gè)特定的pH值，在該pH值下，分子上沒有凈電荷。
       

　　圖1顯示了IEX的分離機(jī)理。當(dāng)極性或帶電分析物被裝載到離子交換柱中時(shí)，它們將靜電結(jié)合到固定相顆粒表面上的帶相反電荷的離子上。分析物分子表面的正電荷或負(fù)電荷越多，對固定相中帶相反電荷的顆粒的靜電吸引力越強(qiáng)。目標(biāo)分析物的保留時(shí)間還取決于與固定相相互作用的次數(shù)。含有緩沖液和鹽的含水流動相用于通過改變pH值或離子強(qiáng)度來洗脫結(jié)合的分析物。

　　通過增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度在IEX分離分析物的示意圖。從裝載、吸附和洗脫到柱再生結(jié)束，分子在柱中移動。

　　圖1:顯示通過增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度在IEX中分離分析物的示意圖。


　　IEX過程有五個(gè)主要步驟：2

　　1.平衡——步，用初始緩沖液(初始緩沖液組合物)洗滌固定相，直到基線穩(wěn)定并且洗脫液的pH值保持恒定。這一步驟確保了色譜柱上的可電離基團(tuán)能夠與帶電的分析物分子相互作用。

　　2.上樣——將溶解在初始緩沖液或與初始緩沖液pH值相同的緩沖液中的樣品注入色譜柱。調(diào)節(jié)緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度，使被分析物能與色譜柱結(jié)合，而雜質(zhì)不能。

　　3.清洗  ——用初始緩沖液再次清洗色譜柱，以去除不帶電荷的分子和帶有與固定相相同電荷的分子。一旦雜質(zhì)被洗掉，基線就會穩(wěn)定下來。

　　4.洗脫——當(dāng)洗脫緩沖液中的離子競爭并取代色譜柱表面帶電位置上的分析物時(shí)，鹽梯度用于洗脫結(jié)合的分析物。在低離子強(qiáng)度下，弱結(jié)合的分析物(表面電荷密度低的分子)開始從色譜柱中洗脫出來。隨著鹽濃度的增加，表面電荷密度越來越高的強(qiáng)結(jié)合分子依次從色譜柱上洗脫下來。或者，可以使用pH梯度洗脫結(jié)合的分析物，這些分析物以各自的pI值從柱中釋放出來。為了洗脫陽離子，增加洗脫緩沖液的pH，同時(shí)通過降低洗脫緩沖液的pH從陰離子交換柱中洗脫陰離子。如果分子在其pI值沉淀，則不能使用pH梯度。

      5.色譜柱再生——最后，通過洗去結(jié)合在柱上的任何分子，柱的容量可以恢復(fù)用于下一次操作。因此，允許高離子強(qiáng)度緩沖液流經(jīng)色譜柱，直到洗脫液的基線和pH值穩(wěn)定。然后在下次運(yùn)行前用初始緩沖液調(diào)整色譜柱。


　　雖然紫外線或熒光檢測器在IEX，但也使用其他檢測器，如質(zhì)譜儀、折光率(RI)或多角度光散射(MALS)檢測器。