DAP-seq助力揭示多年生黑麥草轉(zhuǎn)錄因子LpNAC22增強(qiáng)耐旱性的分子機(jī)制

2025年6月10日，西北農(nóng)林科技大學(xué)秦濤教授團(tuán)隊(duì)在Plant, Cell & Environment發(fā)表了題為“NAC Transcription Factor LpNAC22 Positively Regulates Drought Tolerance in Perennial Ryegrass”的研究論文。該研究從多年生黑麥草中分離出干旱誘導(dǎo)的NAC轉(zhuǎn)錄因子LpNAC22，借助DAP-seq系統(tǒng)解析了LpNAC22通過調(diào)控LEA家族基因增強(qiáng)耐旱性的分子機(jī)制，為牧草抗旱分子育種提供了關(guān)鍵理論依據(jù)與基因靶點(diǎn)。

研究背景

多年生黑麥草是全球溫帶地區(qū)廣泛使用的牧草和草坪草，但對(duì)干旱敏感，缺水會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)、turf質(zhì)量和生產(chǎn)力下降。植物通過分子和生理機(jī)制抵抗干旱，其中轉(zhuǎn)錄因子（如NAC）起重要調(diào)控作用。盡管NAC在多種植物中被證明與耐旱相關(guān)，但多年生黑麥草中NAC的耐旱調(diào)控機(jī)制尚不明確。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

作者從多年生黑麥草中分離出13個(gè)與NAC轉(zhuǎn)錄因子高度同源的編碼序列，其中LpNAC22在干旱脅迫后轉(zhuǎn)錄水平更高，且在高抗旱性品種中表達(dá)量顯著高于低抗旱性品種。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其與多個(gè)干旱響應(yīng)型NAC蛋白屬于同一亞組。亞細(xì)胞定位表明LpNAC22定位于細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄活性分析顯示其具有轉(zhuǎn)錄激活功能，且轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域位于C端（138-331氨基酸）。

圖1. LpNAC22轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)分析與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

圖2. LpNAC22的亞細(xì)胞定位與轉(zhuǎn)錄活性分析。

作者接著研究了LpNAC22在調(diào)控多年生黑麥草耐旱性中的功能。干旱處理誘導(dǎo)LpNAC22表達(dá)后，其在擬南芥和多年生黑麥草中過表達(dá)均能提高植株存活率、相對(duì)含水量和葉綠素含量，降低丙二醛含量、離子滲漏和活性氧積累，減輕細(xì)胞損傷，增強(qiáng)耐旱性。進(jìn)一步構(gòu)建了兩個(gè)突變株系（Ri2和Ri3），干旱處理前突變株系與野生型植株表型和生理指標(biāo)無差異；但干旱處理后，突變株系存活分蘗率、株高、干重、相對(duì)含水量和葉綠素含量均低于野生型，離子滲漏率、丙二醛含量及活性氧積累則高于野生型，表明LpNAC22突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷加劇。以上結(jié)果表明，LpNAC22在多年生黑麥草抗旱性調(diào)控中起正向作用。

圖3. LpNAC22過表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草的耐旱性。

圖4. LpNAC22基因突變削弱多年生黑麥草的干旱處理耐受性。

為探究LpNAC22調(diào)控抗旱性的機(jī)制，作者通過DAP-seq分析，發(fā)現(xiàn)9165個(gè)啟動(dòng)子片段被富集，覆蓋5195個(gè)基因。GO富集分析表明其中富集多種脅迫響應(yīng)基因，包括水分剝奪相關(guān)基因。值得注意的是，8個(gè)LEA家族基因的啟動(dòng)子區(qū)域在DAP-seq結(jié)果中呈現(xiàn)顯著富集，結(jié)合生理實(shí)驗(yàn)中LpNAC22過表達(dá)植株細(xì)胞膜損傷減輕的表型（MDA含量降低、離子滲漏減少），推測(cè)LpNAC22可能通過調(diào)控LEA基因表達(dá)保護(hù)細(xì)胞膜以增強(qiáng)抗旱性。進(jìn)一步通過酵母單雜交（Y1H）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，LpNAC22能特異性結(jié)合LpLEA1和LpLEA2-1的啟動(dòng)子片段，并激活LacZ報(bào)告基因表達(dá)。后續(xù)經(jīng)ChIP-qPCR、EMSA及熒光素酶報(bào)告基因實(shí)驗(yàn)多維度驗(yàn)證，證實(shí)LpNAC22可直接結(jié)合上述LEA基因啟動(dòng)子并激活其轉(zhuǎn)錄。

圖5.LpNAC22直接調(diào)控LpLEA1和LpLEA2-1的表達(dá)水平。

大量研究表明膜穩(wěn)定是LEA蛋白響應(yīng)干旱脅迫的主要機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱處理可誘導(dǎo)LpLEA1和LpLEA2-1表達(dá)，且其編碼蛋白定位于細(xì)胞膜，暗示二者可能在干旱下維持膜完整性。因未能獲得過表達(dá)這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草，故用擬南芥轉(zhuǎn)基因株系分析表型。結(jié)果顯示，干旱條件下野生型多數(shù)萎蔫，而過表達(dá)株系存活率更高，離子滲漏率和MDA含量更低。這些結(jié)果表明，LpLEA1和LpLEA2-1能減輕細(xì)胞膜損傷，增強(qiáng)植株抗旱性。

圖6. LpLEA1和LpLEA2-1的過表達(dá)可緩解干旱條件下植物細(xì)胞膜的損傷。

研究結(jié)論

本研究鑒定了多年生黑麥草中的干旱誘導(dǎo)型核轉(zhuǎn)錄激活因子LpNAC22，證實(shí)其通過直接調(diào)控LEA家族基因LpLEA1和LpLEA2-1的表達(dá)來增強(qiáng)植物的耐旱性，為多年生黑麥草的耐旱分子育種提供了重要的基因資源和理論依據(jù)。