m6A MeRIP-seq聯合Ribo-seq的研究思路

文章題目：METTL16 exerts an m6A-independent function to facilitate translation and tumorigenesis

發表期刊：Nature Cell Biology (5年影響因子：24.2)

研究單位：Beckman Research Institute of City of Hope，The University of Chicago，City of Hope Comprehensive Cancer Center等。

主要內容：METTL16作為一種最近被鑒定的RNA甲基轉移酶，可以對一些轉錄本進行m6A修飾。METTL16能否對轉錄本進行RNA甲基化修飾目前尚不清楚。該研究揭示了METTL16在基因調節中表現出甲基轉移酶活性依賴和非依賴的雙重作用。在細胞核中，充當m6A的writer將m6A“寫入”到數百個特定mRNA靶標中。在細胞質中，METTL16以一種m6A非依賴性方式促進翻譯。METTL16通過Mtase結構域與真核翻譯起始因子eIF3a/b和rRNA相互結合，促使翻譯起始復合體的組裝，并促進超過4000條mRNA轉錄本的翻譯。此外，METTL16對肝細胞癌的腫瘤發生至關重要。總之，該研究揭示了METTL16在肝癌中通過RNA甲基化和翻譯調控的雙重功能促進腫瘤發生。

研究意義：該研究揭示了METTL16不僅通過m6A修飾調控基因表達，還通過與eIF3a/b和rRNA相互作用促進翻譯起始，從而推動腫瘤生長。靶向METTL16/eIF3a/eIF3b軸可能代表癌癥治療的新策略，未來開發針對METTL16 Mtase結構域的有效抑制劑，可能為癌癥治療提供新的方向。

研究結果：

1. METTL16的m6A修飾功能

METTL16是METTL家族成員之一，主要分布在細胞質中，少量分布于細胞核，這與主要位于細胞核的METTL3/14不同。研究發現，METTL16可以對mRNA轉錄本進行m6A修飾，但其全局m6A修飾程度低于METTL3/14。通過m6A MeRIP-seq和QQQ-MS分析，發現METTL16缺失導致3075個轉錄本的m6A豐度顯著降低，其中334個是METTL16特異性靶標，主要參與細胞周期、凋亡、RNA結合和轉錄調節等過程。此外，METTL16在新轉錄RNA的m6A修飾中起重要作用，尤其是在外顯子中。

圖1. METTL3，METTL14和METTL16的亞細胞分布和對m6A的的催化活性比較分析。

2. METTL16促進全局翻譯效率

METTL16不僅參與m6A修飾，還顯著提高翻譯效率。實驗表明，METTL16顯著提高熒光素酶的翻譯效率，甚至超過METTL3。METTL16缺失明顯減弱蛋白質合成，且這種抑制不能通過METTL3/14的高表達恢復。METTL16定位于5'cap區域，參與翻譯起始過程，表明其在翻譯調控中的重要作用。Ribo-seq鑒定了METTL16 KO介導的翻譯抑制事件，這些差異TE轉錄本主要在RNA結合、RNA加工、細胞周期和mRNA代謝過程等途徑中富集。

圖2. METTL16提高了靶RNA的翻譯效率。

3. METTL16與eIF3a/b結合促進翻譯啟動

METTL16通過與翻譯起始因子eIF3a/b直接結合，促進翻譯起始。Co-IP實驗證實METTL16與eIF3a/b直接互作，且這種相互作用不受RNA影響。原位鄰位連接分析（PLA）進一步驗證了METTL16與eIF3a/b在細胞質中的物理相互作用。Polysome profiling分析發現METTL16和eIF3a/b在40/60/80S核糖體中富集，表明其參與翻譯起始過程。METTL16介導的翻譯起始與其甲基轉移酶活性無關。

圖3. METTL16通過與eIF3a和eIF3b直接結合，促進翻譯啟動。

4. METTL16的Mtase結構域在翻譯調控中的作用

METTL16的Mtase結構域（79-289aa）直接與eIF3a/b結合，對METTL16介導的翻譯效率至關重要。通過截短突變體實驗，發現Mtase結構域對于METTL16與eIF3a/b和5'cap的結合是不可少的。此外，METTL16在胞質中發揮主要生物學作用，NLS突變體能夠恢復翻譯抑制和生長抑制。

圖4. 翻譯調控既需要MTTL16的Mtase結構域，也需其胞質定位。

5. METTL16與rRNA相互作用促進80S TIC的形成

METTL16通過與18S rRNA（40S核糖體亞基）和28S/5.8S rRNA（60S核糖體亞基）相互作用，促進80S翻譯起始復合物（TIC）的形成。METTL16促進eIF3復合物與40S核糖體亞基的相互作用，進而促進43S前起始復合物（PIC）的組裝和80S TIC的形成。核糖體圖譜分析顯示，METTL16缺失顯著減少了80S核糖體的形成。

圖5. METTL16與eIF3a/b和rRNA相互作用，促進80S TIC的形成。

6. METTL16在肝細胞癌（HCC）中起促瘤作用

METTL16在肝癌患者中表達顯著升高，且與預后差相關。METTL16缺失顯著抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵入。通過回補實驗，發現野生型METTL16恢復METTL16 KO誘導的生長抑制，而催化失活突變體只能部分恢復。METTL16的Mtase結構域對HCC細胞的生存至關重要，且其致癌作用需要Mtase結構域。異種移植小鼠模型顯示，METTL16缺失在體內顯著抑制HCC腫瘤的形成和進展。

圖6. 在肝癌中METTL16起重要的促進作用。

m6A MeRIP-seq聯合Ribo-seq的研究思路

1. 研究背景

m6A（N6-甲基腺苷）是常見的RNA修飾，影響mRNA的穩定性、翻譯和降解。m6A MeRIP-seq（甲基化RNA免疫共沉淀測序）用于全基因組水平檢測m6A修飾，而ribo-seq（核糖體圖譜測序）則用于研究翻譯過程。聯合這兩種技術可以揭示m6A修飾對翻譯的調控機制。

2. 研究目標

1)     確定m6A修飾在轉錄組中的分布。

2)     分析m6A修飾對翻譯效率的影響。

3)     探索m6A修飾在特定生物過程中的作用。

3. 實驗設計

3.1 樣本準備

1)     選擇合適的細胞系或組織樣本。

2)     分為實驗組和對照組，如敲除m6A甲基轉移酶或去甲基化酶的細胞。

3.2 m6A MeRIP-seq

1)     RNA提取與片段化。

2)     使用m6A特異性抗體進行免疫沉淀。

3)     建庫測序，識別m6A修飾位點。

3.3 Ribo-seq

1)     提取核糖體保護的RNA片段。

2)     建庫測序，分析翻譯效率（TE）。

3.4 數據分析

1)     m6A MeRIP-seq數據分析：識別m6A峰，定位修飾位點。

2)     ribo-seq數據分析：計算翻譯效率，識別翻譯活躍區域。

3)     聯合分析：整合m6A MeRIP-seq和Ribo-seq數據，識別受m6A調控的翻譯事件。比較m6A修飾與翻譯效率的關系，識別受m6A調控的基因。

4)     功能富集分析：GO和KEGG分析受m6A調控的基因功能。

5)     網絡分析：構建m6A修飾與翻譯調控的分子網絡。

4. 驗證實驗

1)     qPCR驗證m6A修飾和翻譯效率的變化。

2)     Western blot驗證目標蛋白表達水平。

3)     CRISPR/Cas9編輯m6A修飾位點，驗證功能。

5. 預期結果

1)     繪制全基因組m6A修飾圖譜。

2)     了解受m6A調控的翻譯事件列表。

3)     揭示m6A在特定生物過程中的調控機制。

6. 研究意義

1)     深化對m6A修飾功能的理解。

2)     全面解析m6A修飾對翻譯的調控機制。

3)     為疾病治療提供新靶點。