雙熒光素酶報告基因實驗步驟

雙熒光素酶報告基因實驗（Dual-Luciferase Reporter Assay）是一種常用的分子生物學技術，用于研究基因表達調控、信號轉導通路以及藥物篩選。該實驗利用了兩個不同的熒光素酶報告基因：螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase，通常作為實驗報告基因）和海腎熒光素酶（Renilla Luciferase，通常作為內參報告基因）。這兩種熒光素酶具有不同的發光底物和發光光譜，可以在同一實驗中獨立測量其活性。

實驗步驟：

構建報告基因載體：

將感興趣的啟動子或調控元件克隆到螢火蟲熒光素酶基因（luc）上游，構建成實驗報告基因載體。

將海腎熒光素酶基因（hRluc）構建到另一個載體中，通常與一個恒定表達的啟動子（如SV40）連接，用作內參報告基因。

細胞轉染：

將上述兩個載體共同轉染入細胞中。實驗報告基因的表達水平將受到研究的啟動子或調控元件的影響，而內參報告基因的表達水平相對恒定，用于校正轉染效率和細胞活性。

細胞培養：

在特定條件下培養轉染細胞，使其表達熒光素酶基因。

裂解細胞：

收集并裂解細胞，釋放熒光素酶。

測定熒光素酶活性：

首先，加入螢火蟲熒光素酶的底物（如熒光素），測定發光強度。螢火蟲熒光素酶催化底物發生化學反應，發出綠色熒光，強度與螢火蟲熒光素酶的活性成正比。

然后，加入海腎熒光素酶的底物（如共elenterazine），測定發光強度。海腎熒光素酶催化底物發出藍色熒光，強度與海腎熒光素酶的活性成正比。

通過加入特定底物分別測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的發光強度。

數據分析：

計算螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性的比值（通常是螢火蟲熒光素酶活性除以海腎熒光素酶活性）。這種比值可以校正轉染效率和細胞數目差異，得到更為準確的實驗結果。