PCR實(shí)驗(yàn)RNA酶抑制劑介紹

下面介紹３種廣泛應(yīng)用的特異性RNA酶抑制劑。
1、RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑是 從人胎盤分離的一種蛋白質(zhì)可與多種RNA酶緊密結(jié)合（KI≈3x1010）形成非共價(jià)結(jié)合的等摩爾復(fù)合物，使RNA酶失活。此蛋白質(zhì)體內(nèi)可能是血管生成素的抑制劑，血管生成素是氨基酸序列和推測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)與胰RNA酶類似的一種血管生成因子， 幾個(gè)廠家以不同的商品名出售這種抑制劑，該蛋白質(zhì)應(yīng)置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50％甘油中，貯存于－20℃。抑制劑制品凍融數(shù)次后或放置在氧化條件下即應(yīng)棄之不用，因?yàn)樯鲜鎏幚頃?huì)使蛋白質(zhì)變性從而釋放出所結(jié)合的RNA酶。因此，在使用變性劑裂解哺乳動(dòng)物細(xì)胞這一提取RNA的初始步聚中不應(yīng)使用這種蛋白抑制劑。然而職用更溫和的裂解方法時(shí)應(yīng)使用這種抑制劑，并且在后續(xù)的所有RNA純化步驟中均應(yīng)有此蛋白質(zhì)存在。由于酚抽提可以除蛋白質(zhì)抑制劑，故應(yīng)在純化過(guò)程中補(bǔ)加幾次抑制劑。其最大活性的發(fā)揮要求巰基試劑，而且它并不干擾反轉(zhuǎn)錄或mRNA在無(wú)細(xì)胞體系中的翻譯。
2、氧釩核糖核苷復(fù)合物 這種由氧釩（1V）離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復(fù)合物，是量種過(guò)渡態(tài)類似物，它能與多種RNA酶結(jié)合并幾科能100%地抑制RNA酶的活性。這４種氧釩核糖核苷復(fù)合物可加入完整細(xì)胞中，在RNA提取和純化的所有過(guò)程中，其使用濃度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母細(xì)胞中進(jìn)行翻譯， 并能作為某些外酶促反應(yīng)（如mRNA反轉(zhuǎn)錄）的模板。然而氧釩核糖核苷復(fù)合物強(qiáng)烈抑制mRNA在無(wú)細(xì)胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1 ％羥基喹淋的C6H5OH[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有幾家公司出售氧釩核糖核苷復(fù)合物。
3、Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就發(fā)現(xiàn)它能吸附RNA酶，用緩沖液將其制成漿液，以0.015％（W/V）的終濃度溶解細(xì)胞。 這種粘土隨同它所吸附的RNA酶可在后續(xù)的RNA純化過(guò)程中（如酚抽提后）經(jīng)離心去除。