細胞凍存的具體操作步驟

    細胞培養的傳代及日常維持過程中，在培養器具、培養液及各種準備工作方面都需大量的耗費，而且細胞一旦離開活體開始原代培養，它的各種生物特性都將逐漸發生變化并隨著傳代次數的增加和體外環境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。

細胞凍存的具體操作步驟：

1、配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛血清的凍存培養液;

2、取對數生長期的細胞，去除舊培養液，用 PBS 清洗。

3、去除 PBS，加入適量yi蛋白酶 (覆蓋培養皿表面) 把單層生長的細胞消化下來;

4、離心 1000rpm，5min;

5、去除yi蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為 5×106/ml~1×107/ml;

6、將細胞分裝入凍存管中，每管 1~1.5 ml;

7、在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者;

8、凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/ min;當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。