DAP-seq與RNA-seq聯合分析助力揭示AvERF73參與調控低氧應答和甲羥戊酸途徑

澇害（Waterlogging）是長期陰雨或暴雨后，由于地表積水，地面徑流不能及時排除，積水深度過大，時間過長，造成作物根部氧氣不足，并產生乙醇等有毒有害物質，從而影響作物生長，甚至造成作物死亡，造成農業減產的災害。

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）也稱奇異果，原產于中國。目前已經躋身于世界主流消費水果之列。獼猴桃可以預防老年骨質疏松，防治動脈硬化，改善心肌功能，防治心臟病，也能對抗癌起作用。

2024年2月2日，中國農業科學院鄭州果樹研究所果樹生長發育與質量控制重點實驗室的研究成果，發表在Horticultural Plant Journal期刊上（IF=5.7），文章題目為“AvERF73 positively regulates waterlogging tolerance in kiwifruit by participating in hypoxia response and mevalonate pathway” 。該研究使用DNA親和測序（DAP-seq）技術和轉錄組測序（RNA-seq）技術揭示了AvERF73通過參與低氧應答和甲羥戊酸途徑，正調控獼猴桃的耐澇性。

1.對AvERF73進行序列分析

作者在A. valvata KR5中鑒定出一個受洪澇誘導的ERF-VII基因，命名為AvERF73。隨后，作者檢測了AvERF73在不同組織中的表達情況，發現其在根系中的含量最高。系統發育樹分析顯示，AvERF73與AcERF74的蛋白序列相似。蛋白序列分析顯示，AvERF73含有一個AP2保守結構域，這個結構域含有Ala14和Asp19保守位點，說明AvERF73屬于ERF轉錄家族。之后作者將AvERF73與GFP融合表達，并在細胞核中檢測到GFP熒光，證明AvERF73定位于細胞核中。

2.在擬南芥中過表達AvERF73提高了擬南芥的耐澇害能力

為研究AvERF73基因的功能，作者在擬南芥中過表達AvERF73基因，進行澇脅迫，發現過表達植株比WT植株更耐澇害，證實了AvERF73的過表達增強了擬南芥的耐澇害能力。

3.過表達AvERF73增強了獼猴桃的耐澇害能力

為進一步證實AvERF73在獼猴桃中的作用，作者利用“紅陽”獼猴桃葉條外植體轉化獲得了兩個過表達的獼猴桃品系OE53和OE65。澇脅迫后， 與過表達品系相比，WT植株出現了明顯的葉片枯萎癥狀，葉綠素水平降低，根部H2O2和MDA含量升高，而過表達品系生長良好。表明AvERF73在應對澇脅迫方面發揮著有益的作用。

4.轉錄組分析鑒定AvERF73調控的基因

為了更好地探究AvERF73在澇脅迫下的分子機制，作者對OE53和WT植株進行轉錄組測序（RNA-seq）。qRT-PCR檢測和相關性分析均表明轉錄組數據準確可靠。結果分析發現，在澇脅迫下，與WT植株相比，OE53植株的上調基因在“cellular response to hypoxia”途徑顯著富集，這些低氧應答基因（HRGs )包含很多轉錄因子，例如LOB，WRKY，鋅指蛋白和NAC。，此外，上調基因在萜類化合物和甾醇生物合成過程也顯著富集，并且編碼MVA途徑關鍵酶的基因表達上調。由此推測AvERF73可能調控HRGs的表達，同時激活MVA通路積累萜類化合物和甾醇來應對澇脅迫。

5.全基因組范圍內鑒定AvERF73的靶基因

為了鑒定AvERF73調控的靶基因，作者以OE53和WT植物的根部為材料進行了DAP-seq。兩次重復共鑒定到3744個基因，同時鑒定到AvERF73結合的GCC-box (‘GCCGCC’) motif。隨后作者將DAP-seq與RNA-seq數據聯合分析，找到了16個上調的AvERF73 可能直接靶向基因（DTGs）并進行重點關注。

6.AvERF73直接參與缺氧應答和MVA通路提高獼猴桃的耐澇漬能力

為了進一步揭示AvERF73的潛在DTG。Venn圖分析發現，在"cellular response to hypoxia"和MVA途徑中，AcNAC022和AcHMGS1基因為AvERF73的潛在DTGs。Dual-Luc實驗發現AcNAC022和AcHMGS1與AvERF73蛋白呈正相關關系。據此推測，AvERF73調控了AcNAC022和AcHMGS1的表達。

小結

結果表明，AvERF73是獼猴桃耐澇性的重要調節因子。一方面，過表達AvERF73可以激活AcNAC022的表達，以應對澇脅迫引起的缺氧。另一方面，過表達AvERF73可能通過直接激活AcHMGS1表達來調節合成萜類化合物和甾醇的MVA途徑。然而，AvERF73與AcNAC022和AcHMGS1的相互作用調控獼猴桃耐澇能力的機制有待進一步探索。本研究結果為研究獼猴桃耐澇調控網絡提供了候選基因和新思路。