免疫組化（IHC）實驗步驟是怎樣的呢？

來源：北京百奧創新科技有限公司 2023年10月31日 10:01

做實驗時最基礎的就是深刻的銘記原理，如此在實驗的實操階段才能真正做到胸有成竹。簡單來說，免疫組化就是一項利用抗原抗體反應來確定組織細胞內抗原和對蛋白定位、定性的實驗技術。免疫組化（IHC）實驗步驟是怎樣的呢？一起來學習一下吧！

1.脫蠟與水化：將石蠟切片放置于60°烤箱烤片30-60min，這一步是為了使蠟片水分蒸發和石蠟融化，好讓組織切片牢固地貼在玻片上。而后依次將其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接對著切片沖洗）。PBS洗3次，3 min/次。

2.細胞通透與封閉：用預熱的封閉通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸潤切片30min（RT 避光），降低內源性過氧化物酶的活性。PBS洗3次，3 min/次。

3.抗原修復：由于制作石蠟切片時，甲醛固定使得蛋白之間交聯及醛基的封閉作用從而失去抗原性，這一步就是讓胞內的抗原決定簇重新“滿血復活”。

比較常用的是微波修復，pH 6.0的0.01M檸檬酸鈉緩沖液浸泡切片，在微波爐里高火4min至沸騰后，取出自然冷卻至室溫，重復2次，每次補足液體以免干片。（當然有的朋友用酶修復法也是可以的）。PBS洗3次，3 min/次。

4.血清封閉：用與二抗同一來源的血清封閉一些非特異性結合位點。此時可用油性筆圍繞組織畫圈，并對圈內的組織滴加稀釋好的血清，37℃溫箱中30min,用濾紙吸去多余的血清。

5.孵育一抗：對圈內的組織（面積為1×1）滴加稀釋好的一抗20ul，4℃過夜或者37℃ 1-2h。PBS洗3次，3 min/次。（一般4℃過夜后，需要將切片放置37℃復溫45min，防止脫片以及可使抗原抗體結合的更穩定）

6.孵育二抗：對圈內的組織（面積為1×1）滴加稀釋好的二抗20ul，37℃ 1-2h，PBS洗3次，3 min/次。

7.切片顯色：用DAB-H2O2顯色10min，顯色液最好是現用現配，此時要通過顯微鏡觀察染色是否明顯，10min內即可用蒸餾水終止顯色。

8.復染及封片：為了形成細胞輪廓，更好的定位目標蛋白，可用Mayer蘇木素染色30s，水洗，鹽酸酒精分化2s，流水浸入15min。脫水時，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各2min。二甲苯5min使切片透明化，最后加入中性樹膠封片（一般封片后最好立即拍照，若不能及時拍照，可用指甲油封固并保持好避光和濕度）。

以上就是關于免疫組化（IHC）實驗步驟是怎樣的問題解答，如果你想了解更多請咨詢百奧創新客服哦~

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