siPOOLs常見問題解答（FAQ）

1. siPOOLs如何提高基因敲低的特異性和效率？

siPOOL是一款包含30條siRNAs的、高復雜度的混池，通過降低每條siRNA的實驗相關性以稀釋其脫靶效應。專有的siPOOL設計算法，可確保較高的轉錄本覆蓋率，且避免旁系同源基因，提高基因敲低的效率和特異性。此外，生產的siPOOL包含了規定長度和高純度的siRNA標準品，從而大大降低非特異性影響的風險。

2. siPOOLs與其他市售siRNA池有什么區別？

其他市售siRNA池要么是3-4個siRNA的低復雜度混池，要么是不同siRNA長度的隨機混池。相比之下，siPOOLs是一款好用、高復雜度、確定長度的siRNA混池。

3. 如果我訂購一個siPOOL，總量有多少？我可以用它做多少個反應？

對于每個靶基因，siPOOL的規格有5、10或20 nmol。當siPOOL濃度為1nM時，5 nmol至少足夠用于6孔板的2250個孔或者96孔板的45000個孔（參見siPOOL轉染方案）。10個及以上的siPOOL批量訂單，可以定制1-2 nmol的小規格。請聯系我們獲取定制報價。

4. 從下單到交貨需要多長時間？

我們需要大約3-4周的時間來交付新的siPOOL。而對于已有庫存的siPOOLs，可在2周內交貨。根據序列的不同，某些siPOOLs可能需要更長的時間來合成。我們將會根據實際情況及時和您溝通是否會延遲交貨。

5. siPOOL可以針對的最小序列長度是多少？

通常，目標基因的特異性序列≥300個堿基就可以設計siPOOL。在保持種子序列多樣性的條件下，siRNA之間存在一定程度的序列重疊是沒有問題的。請將您的序列信息發送給我們，經過評估后我們會告知您設計的可行性及建議。

6. 購買siPOOL有什么保證呢？

針對所有編碼基因的siPOOLs均在包含驗證的保證范圍內。當以高達10nM濃度使用siPOOL，且在轉染24小時后做RNA定量檢測分析，我們保證敲低率≥70%。在表達給定靶標的標準細胞系中，陽性對照siRNA應獲得最佳的轉染條件。如果沒有看到≥70%的敲低率，我們將根據可用的序列免費為客戶重新設計、合成、驗證和發貨一個新的siPOOL。由于敲低效率也會隨著基因的特性而發生變化，因此使用新的siPOOL能否提高敲低效率，我們無法做出保證。

針對非編碼基因的siPOOL，如果未達到≥60%的敲低率，則根據可用的序列進行重新合成。不過，驗證和運輸的費用需由客戶自己承擔。

7. 為什么不提供針對長非編碼RNA（lncRNA）的siPOOL驗證？

由于二級結構、結合蛋白或細胞定位等因素限制了RNAi機制發揮作用，因此通過RNAi沉默長非編碼RNA（lncRNA）更具挑戰性。根據可用的轉錄序列，我們將提供一輪siPOOL重新設計和合成，以靶向lncRNA的不同區域。然而，siPOOL的驗證工作最好還是由熟悉該lncRNA特性的客戶自己開展。

8. 可以提供免費樣品進行測試嗎？

目前，只有0.1 nmol陽性對照（GAPDH / KIF11 / INCENP）和陰性對照siPOOLs可供免費測試。我們歡迎您對經常評估的基因提出建議，未來將有可能會將其作為陽性對照。

9. 能否以更低的價格提供較小規格的siPOOL給到我們進行測試或篩選？

≥ 10個 siPOOLs的批量訂單，可以提供較小的規格，如1-2 nmol。人激酶siPOOL庫和siPOOL癌癥工具箱中的預定義siPOOLs也可用于制定較小的規格。請聯系我們獲取報價。

10. 對于核定位的RNA，siPOOLs有效嗎？

已經有存在于細胞核中的RNAi機制的相關報道，一些針對核定位RNA（例如MALAT1，XIST）的siPOOLs可以達到70%的敲低效率。然而，細胞質定位的RNA可能會更有效地被RNAi靶向。

11. siPOOLs可以組合在一起同時敲低幾個基因嗎？

是的。siPOOLs在低納摩爾濃度下是有效的。這允許在單個應用中組合多個siPOOLs，以沉默多個基因，同時將副作用的風險大大降低。

在一項研究中，siPOOLs同時成功地沉默多達四個基因的表達 [Welsbie, D. S. et al. Enhanced Functional Genomic Screening Identifies Novel Mediators of Dual Leucine Zipper Kinase-Dependent Injury Signaling in Neurons. Neuron 94(6), 1142–1154.e6 (2017)]。

12. 我應該使用什么濃度的siPOOL？

在標準細胞系（例如HeLa，Hek293，A549，MCF7）中，siPOOL通常在借助脂質體轉染試劑的情況下采用1-3 nM的濃度。在難轉染的細胞中，可能需要更高的濃度，并且可以采用電穿孔等替代方法。我們建議先設置不同的濃度梯度，以確定具有穩定敲低效率的較低濃度。對于長期的基因敲低（>3天），建議使用更高的初始siPOOL濃度。另外，我們也可以為您提供劑量優化服務，我們會采用7個濃度梯度進行試驗。如需了解更多信息，請聯系我們。

13. siPOOL介導的基因敲低效果能持續多久？

siPOOL敲低基因的持續時間與其他siRNA相似，取決于細胞系和靶基因。基因敲低效果通常可持續4-7天。但是，高增殖率的細胞或高活躍度的基因可能會維持更短的時間。通過siPOOLs的再轉染或提高siPOOL初始濃度的轉染，也許可以延長基因敲低效果的持續時間。

14. siPOOL可以靶向特定的亞型嗎？

已證明，siPOOL能夠以高特異性和高效率成功地靶向選定亞型。然而，成功概率還取決于該亞型專有的序列可用性。如有需要，請將您的轉錄本NCBI ID發送給我們，我們可以為您作出評估。另外，我們還可為您提供跨亞型或物種選擇性的siPOOL驗證服務。

15. siPOOL的陰性對照是什么？

我們使用不與人類、小鼠和大鼠基因相互作用的標準陰性對照siPOOL（30個siRNAs）。它已在多個細胞系中進行了測試，對細胞增殖、凋亡或細胞形態沒有顯著影響。另外，我們也可以根據需要提供Scrambled陰性對照siPOOL，對靶siRNA序列進行加擾以避免靶標相互作用，同時保持GC含量的百分比（%）。

16. 您的陽性對照siPOOL是什么，讀數是多少？

陽性對照siPOOL是預先經過驗證的siPOOL，當轉染細胞時會產生確定的表征，表明轉染成功。目前，可用的陽性對照siPOOL所對應的基因，包括：人KIF11（3832），可產生有絲分裂停滯和可觀察到的細胞死亡現象；人INCENP (3619)，可產生在顯微鏡下可觀察到的細胞增大表型；人GAPDH（2597），其不產生可觀察到的表型，但通過定量PCR檢測GAPDH的RNA水平時，表現為顯著的下調。也可提供針對小鼠的GAPDH（14433）和KIF11（16551）的陽性對照siPOOL。

17. siPOOLs可以針對除人類，小鼠和大鼠以外的其他物種嗎？

是的，siPOOLs可以針對任何物種。請向我們提供目標物種、宿主系統和目標序列。

18. siPOOLs的轉染條件與其他siRNA有什么不同嗎？

沒有太大的差別。您可以將已經優化好的siRNA轉染條件應用于siPOOLs轉染中。

19. 有推薦的轉染試劑嗎？

市面上的轉染試劑種類繁多。對于許多常見的細胞系，采用Lipofectamine的轉染效果就很好。然而，原代巨噬細胞或非貼壁細胞等細胞類型的轉染可能會存在更多的挑戰。我們可為您提供細胞系轉染優化服務，我們將測試3種轉染方法。如需了解詳情，請聯系我們。

20. siPOOL的保質期是多久？

siPOOLs在-20°C下儲存時，至少可以穩定6個月。盡管我們觀察到siPOOL在保存幾年后仍存在活性，但是，我們推薦您在收到產品后盡快使用，盡量不超過保質期。另外，強烈建議您將較大的體積分裝成小體積再進行保存，以避免多次反復凍融影響實驗結果。

21. siPOOL可以作為一種可發表的驗證方法嗎？

是的。siPOOLs不僅可以用于常規的基因敲低實驗，而且可以作為其他技術（如CRISPR，單個siRNA或shRNA）的補充驗證方法。在使用siPOOLs進行發表時，請引用“siTOOLs Biotech”以及Hannus et al., Nucleic Acids Res, 2014文獻。

22. 是否可以進一步的驗證siPOOL，例如：開展回補實驗？

是的。siPOOL敲低效果的進一步驗證，可以采用抗siPOOL回補序列（siPOOL-resistant rescue constructs）來開展，它可以表達siPOOL抗性版本的基因以挽救和恢復目標基因的功能。

23. 是否需要反卷積一個siPOOL，來單獨測試siRNAs？

我們不建議對siPOOL進行反卷積，因為這會破壞高復雜性混池化所賦予的高特異性。為了進一步驗證siPOOL結果，我們建議使用抗siPOOL回補序列。

24. siPOOL以什么形式發貨？它們在室溫下穩定嗎？

siPOOL以懸浮液的形式發貨（10 nM Tris，pH 8.0）。siPOOL經測試可在室溫（RT）下穩定至少4周，在37°C下穩定1周，在50°C下穩定24小時。因此，溫暖氣候條件下的運輸延遲，不太對siPOOL的活性產生不利的影響。

25. siPOOL文庫是否可用于功能基因組篩選？

是的。我們有一個包含505個siPOOLs的siPOOL人類激酶庫，可用于高通量功能基因組篩選，以獲得可靠的RNAi效果。另外，用于RNA結合蛋白、E3連接酶和去泛素酶的siPOOL文庫，以及其他定制化文庫，請聯系我們咨詢。