DAP-seq技術(shù)應(yīng)用于蘋果抗旱性和滲透脅迫耐受性調(diào)控機(jī)制研究

蘋果是一種重要的落葉果樹(shù)，廣泛種植在半干旱和干旱地區(qū)。干旱脅迫會(huì)嚴(yán)重影響蘋果的生長(zhǎng)、品質(zhì)和產(chǎn)量。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫響應(yīng)中起關(guān)鍵作用。然而，蘋果中WRKY轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)干旱和滲透脅迫的分子機(jī)制尚不清楚。

2023年5月22日，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)與西北農(nóng)林科技大學(xué)的聯(lián)合研究成果，在線發(fā)表在Horticultural Plant Journal 期刊(Q1區(qū)，影響因子5.7)，文章題目為“Overexpression of the transcription factor MdWRKY115 improves drought and osmotic stress tolerance by directly binding to the MdRD22 promoter in apple”。該研究使用DNA親和純化測(cè)序(DAP-seq)技術(shù)鑒定了蘋果轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY115的結(jié)合基序和靶基因。揭示了MdWRKY115通過(guò)直接結(jié)合MdRD22啟動(dòng)子增強(qiáng)植物對(duì)干旱和滲透脅迫耐受性的調(diào)節(jié)機(jī)制。

該研究從“金冠”蘋果品種的葉片中克隆了MdWRKY115基因，該基因編碼包含356個(gè)氨基酸的蛋白。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明MdWRKY115蛋白具有一個(gè)非常保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，是第Ⅲ組WRKY家族成員之一。

圖1. 不同植物中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

qRT-PCR結(jié)果說(shuō)明，干旱和滲透脅迫下MdWRKY115的表達(dá)上調(diào)。GUS活性分析表明，MdWRKY115的啟動(dòng)子活性在滲透脅迫下明顯增強(qiáng)。亞細(xì)胞定位分析表明，MdWRKY115定位于細(xì)胞核。轉(zhuǎn)錄激活分析表明，MdWRKY115是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子，其轉(zhuǎn)錄激活域位于N端區(qū)域。

圖2. MdWRKY115在干旱和滲透脅迫下的表達(dá)模式及轉(zhuǎn)錄激活分析

轉(zhuǎn)基因株系的表型分析表明，在擬南芥幼苗和蘋果愈傷組織中過(guò)表達(dá)MdWRKY115，顯著提高了它們對(duì)干旱和滲透脅迫的耐受性。

圖3. 在滲透脅迫處理下，過(guò)表達(dá)MdWRKY115的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的表型

圖4. 過(guò)表達(dá)MdWRKY115的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗中與滲透脅迫響應(yīng)相關(guān)的生理變化

圖5. 過(guò)表達(dá)MdWRKY115的轉(zhuǎn)基因擬南芥增強(qiáng)了對(duì)干旱的耐受性

圖6. 在滲透脅迫處理下，過(guò)表達(dá)MdWRKY115的轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織的表型

DAP-seq鑒定了MdWRKY115的結(jié)合元件是W-box基序（核心序列是TTGAC）。通過(guò)對(duì)MdWRKY115結(jié)合位點(diǎn)的篩選發(fā)現(xiàn)，脅迫相關(guān)基因MdRD22是MdWRKY115的潛在靶基因。電泳遷移率測(cè)定（EMSA）驗(yàn)證了MdWRKY115與MdRD22啟動(dòng)子的特異性結(jié)合。此外，通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)MdWRKY115基因能夠促進(jìn)MdRD22的表達(dá)。這些結(jié)果表明，MdWRKY115通過(guò)直接與MdRD22的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控其表達(dá)。

圖7. MdWRKY115直接與MdRD22啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控MdRD22的表達(dá)

小結(jié)：該研究鑒定了蘋果中與干旱和滲透脅迫耐受性相關(guān)的一個(gè)調(diào)控因子MdWRKY115。MdWRKY115是一個(gè)第Ⅲ組WRKY轉(zhuǎn)錄因子，定位于細(xì)胞核，具有轉(zhuǎn)錄激活活性。MdWRKY115通過(guò)與MdRD22啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控MdRD22的表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥和蘋果愈傷組織對(duì)干旱和滲透脅迫的耐受性。總之，該研究為MdWRKY115通過(guò)調(diào)控MdRD22的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)蘋果對(duì)干旱和滲透脅迫耐受性的分子機(jī)制提供了新見(jiàn)解，也對(duì)利用分子遺傳策略培育耐旱植物新品種具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：Dong Q, Tian Y, Zhang X, Duan D, Zhang H, Yang K, Jia P, Luan H, Guo S, Qi G, Mao K, Ma F, Overexpression of the transcription factor MdWRKY115 improves drought and osmotic stress tolerance by directly binding to the MdRD22 promoter in apple, Horticultural Plant Journal.  doi.org/10.1016/j.hpj.2023.05.005.