細胞培養常見問題和解決方法

問題1：培養液pH值變化太快

可能原因

(1)CO2張力不對

(2)培養瓶蓋擰得太緊

(3)NaHCO3緩沖系統緩沖力不足

(4)培養液中鹽濃度不正確

(5)細菌、酵母或真菌污染

建議解決方法

(1)按培養液中NaHCO3濃度增加或減少培養箱內CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對應CO2濃度為5%到10%。

(2)松開瓶蓋1/4圈。

(3)改用不依賴CO2培養液。加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度。

(4)在CO2培養環境中改用基于Earle′s鹽配制的培養液，在大氣培養環境中培養改用Hanks鹽配制的培養液。

(5)丟棄培養物，或用抗生素除菌。

問題2：培養液出現沉淀，但pH值不變

可能原因

(1)洗滌劑清洗后殘留有磷酸鹽，將培養基成分沉淀下來

(2)冰凍保存培養液

建議解決方法

(1)用去離子水反復沖洗玻璃器皿，然后滅菌。

(2)將培養液加熱到37℃，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養液。

問題3：培養液出現沉淀，同時pH發生變化

可能原因

細菌或真菌污染

建議解決方法

丟棄培養物，或用抗生素除菌。

問題4：培養細胞不貼壁

可能原因

(1)*消化過度

(2)支原體污染

(3)培養瓶瓶底不干凈

(4)培養液pH值過堿(NaHCO3分解)

(5)消化液或培養液配制錯誤、過期儲存、儲存不當

(6)細胞老化(如傳代前細胞已匯合導致失去貼附性)

(7)接種細胞起始濃度太低或太高

建議解決方法

(1)縮短*消化時間或降低*濃度。

(2)分離培養物，檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發現支原體污染，丟棄培養物。

(3)注意刷洗，或換用一次性塑料培養瓶

(4)使用無菌醋酸溶液調整pH值或充入無菌CO2(將培養液敞口放入培養箱也可)

(5)重新配置消化液或培養液

(6)啟用新的保種細胞

(7)調節*接種細胞濃度

問題5：懸浮細胞成簇

可能原因

(1)培養液中含鈣、鎂離子

(2)支原體污染

(3)蛋白酶過度消化使得細胞裂解釋

(4)DNA污染

建議解決方法

(1)用無鈣鎂*洗滌細胞，輕輕吹吸細胞獲得單細胞懸液。

(2)分離培養物，檢測支原體。如發現支原體污染，丟棄培養物。

(3)用DNase I處理細胞。

問題6：原代細胞培養物污染

可能原因

原代培養組織在進入培養前已污染

建議解決方法

培養前用含高濃度抗生素的*反復沖洗組織。

問題7：培養細胞生長減慢

可能原因

(1)由于更換不同培養液或血清

(2)培養液中一些細胞生長必需成分如*或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。

(3)培養物中有少量細菌或真菌污染

(4)試劑保存不當

(5)接種細胞起始濃度太低

(6)細胞已老化

(7)支原體污染

建議解決方法

(1)比較新培養液與原培養液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗。讓細胞逐漸適應新培養液。

(2)換入新鮮配制培養液，或補加*及生長因子。

(3)用無抗生素培養液培養，如發現污染，丟棄培養物。或用抗生素除菌。

(4)血清需保存在-5℃到-20℃。培養液需在2-8℃避光保存。含血清*培養液在2-8℃保存，并在2周內用完。

(5)增加接種細胞起始濃度。

(6)換用新的保種細胞。

(7)分離培養物，檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發現支原體污染，丟棄培養物。

問題8：培養細胞死亡

可能原因

(1)培養箱內無CO2

(2)培養箱內溫度波動太大

(3)細胞凍存或復蘇過程中損傷

(4)培養液滲透壓不正確

(5)培養液種有毒代謝產物堆積

(6)更多原因參考問題4和問題7

建議解決方法

(1)檢測培養箱內CO2

(2)檢查培養箱內溫度

(3)取新的保存細胞種

(4)檢測培養液滲透壓。注意：大多數哺乳動物細胞能耐受滲透壓為260– 350 mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養液滲透壓。

(5)換入新鮮培養液

(6)更多解決方法參考問題4和問題7